新生仔猪小肠上皮细胞的分离培养和鉴定作者：王静,张彦明*,仝钢,刘芳宁,周宏超,何雷,杨小云,徐彦召,洪海霞(西北农林科技大学动物医学院,杨凌712100)内容摘要:为更快捷地进行猪肠道病毒性、细菌性疾病及细胞永生化的研究提供便利,本研究使用多种酶消化法及其他培养法尝试分离培养肠上皮细胞。结果,利用组织块培养法能成功建立新生仔猪小肠上皮细胞株,获得的上皮细胞具有较强的增殖能力,22h内贴壁并发生细胞分裂,6~7d明显增殖,10~12d汇合成单层,连续传代培养至12代,细胞基本失去上皮样特征。倒置显微镜下观察,10代前培养细胞为多角状或卵圆形,单层生长不重叠,呈铺路石状排列,11~12代细胞发生变形，间隙增大。细胞角蛋白18鉴定二者均为阳性。电镜下,纹状缘整齐,紧密连接结构清晰可见。结果表明利用组织块培养法可以获得能够连续传代、活力较好的猪小肠上皮细胞。关键词:新生仔猪小肠上皮细胞；；组织块培养；原代培养；；鉴定中图分类号:Q813.1文献标识码:A文章编号:0366-6964(2010)01-0092-07动物细胞的体外培养已被广泛应用于细胞和分子生物学领域。就肠上皮细胞而言,分离培养技术成为深入研究小肠功能、病理和细胞分化的重要工具[1]。肠细胞培养物在生物技术和临床应用方面都有很高的价值,可用作食品、化妆品、抗肿瘤药品和移植药品等的毒力活性检测[2]。国外学者对肠上皮细胞研究较多,虽然分离方法各有不同,但多采用酶消化法,且多局限于小鼠、大鼠和人。啮齿动物肠细胞系如IEC-6[3-5]在研究多种隐窝细胞活性方面,包括增殖活性、细胞迁移、细胞外基质分子的合成[6-8],以及在研究细胞分化方面[6,8-9]都有很重要的意义,相继建成的还有IEC-18[10]。关于猪小肠上皮细胞系,国外已有学者成功建立了来源于成年公猪回肠的IPI-2I[11]以及来源于未吃初乳的乳猪空肠的IPEC-J2[12]和IPEC-1[13],但国内尚无猪小肠上皮细胞连续传代并成功建系的报道。本研究使用组织块培养法成功的培养了猪小肠上皮细胞,为构建小肠上皮细胞系奠定基础。一1、材料与方法（1.1一）材料无菌条件下取出刚出生12h内仔猪的回肠,剔除肠系膜,于加入双抗的PBS培养基中冰浴保存,备用。DMEM/F12培养基(Gibco):添加50mL#L-1的胎牛血清(Gibco)、10ng#mL-1EGF(Sigma)、100U#mL-1青霉素、100Lg#mL-1链霉素、1mmol#L-1的HEPES、ITS-G(Insulin1.0g#L-1+Transferring0.55g#L-1+Selenium0.67mg#L-1)蔗糖-EDTA缓冲溶液:0.45mol#mL-1蔗糖,3.6g#L-1EDTA,1g#L-1牛血清蛋白溶于PBS中,pH7.4。细胞角蛋白18单克隆抗体,SABC免疫组化试剂盒,DAB显色试剂盒和苏木素均购自武汉博士德公司。1.21、仔猪小肠上皮细胞的分离培养（1.2.11）组织块培养法¹无菌条件下剔除肠系膜,将小肠移至培养皿中,用PBS液将小肠内腔冲洗干净。纵向剖开肠管,用PBS和无血清的DMEM/F12反复清洗至液体清亮;º将肠管剪成肉眼可见的碎片,用无血清的DMEM/F12清洗,静置1~2min后。弃去上清,继续剪碎,剪成<1mm3的碎片,再加入无血清DMEM/F12进行清洗,1000r#min-1离心7min;»如上反复清洗组织块,直至上清液澄清;¼用50mL#L-1FCSDMEM/F12悬浮组织块并取适量种植于培养皿或培养瓶中。½培养24h后换液,继续培养。2二、结果2.1IEC不同消化酶液的分离效果由表1可见,2.5g#L-1的胰蛋白酶虽然消化速度较快,但易对细胞造成较大的损害,漂浮死亡的细胞较多,大部分为单个细胞,贴壁和生长能力均较差,而0.2g#L-1的胶原酶Ñ和50mg#L-1的嗜热菌蛋白酶的消化时间较长,易造成其他细胞(成纤维细胞、基质细胞、平滑肌细胞等)量的增加(消化方法同1.2.2)。相对而言,嗜热菌蛋白酶联合胶原酶Ñ可分离出较纯的上皮细胞,但是,分裂数次后停止分裂。组织块培养法是获得上皮细胞最简单的方法。虽然在机械剪碎过程中,对肠隐窝器官样单位会有一定程度的损伤,但相对而言,上皮细胞未经过任何酶处理,获得的细胞活性较强(图1)。3三、讨论（3.1三）肠上皮细胞的分离3.1.13、材料来源本研究选用的是出12h内的未吃初乳的新生猪,此时的乳猪未采食,可避免源头污染。而且新生乳猪的肠上皮细胞生长迅速,增殖能力强。林成招等[15]分别使用成年大鼠和乳鼠获得小肠上皮细胞,发现成年大鼠的分化度高,体外增殖能力弱,绝大多数难以...
