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3、1960年发现多发性骨髓瘤细胞有多种免疫球蛋白。由于病原微生物是含有多种抗原决定族的抗原物质，因此制的这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称为多克隆抗体。易出现非特异性交叉反应。4、1975年KöhlerandMilstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出McAb.在临床上主要用于诊断和治疗。McAb由一个B细胞克隆产生的，只能识别某一个抗原表位的高度特异性抗体。McAb在免疫导向疗法中存在的困难（障碍）：A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有5~6h，难以维持有效药物作用靶组织时间；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。解决问题的方法或途径—基因工程技术A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相对分子质量。5、1984年报道了人—鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的1/80~1/3。6、1994年Winter创建了噬菌体抗体库技术,以基因工程方法制备抗体并发展成抗体工程。它是抗体研究领域的一次技术革命，它不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体。第二节单克隆抗体及其改造（MonoclonalAntibody）一、制备单克隆抗体的一般流程McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。1、抗原与动物免疫免疫方法：体内免疫和体外免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养基本方法：取适量脾细胞（1×108）与骨髓瘤细胞（2×107~3×107）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。用于细胞融合的骨髓瘤细胞的条件：1、融和率高2、自身不分泌抗体3、所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定。PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为40%~50%，相对分子质量4000为佳。相对分子质量在400~6000，浓度在10%~60%范围内的PEG都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO（二甲基亚砜），以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。（1）细胞融合液中的细胞类型：4或5种。（2）如何去除脾-瘤融和细胞以外的细胞？常用选择性培养基细胞融合后，可产生多种融合细胞，如脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤的融合细胞，而且还有许多未融合的骨髓瘤细胞。这些细胞比脾—瘤融合的杂交瘤细胞增殖更快，并能将其淘汰。为此，可再将融合后的细胞立即移入选择性培养基中进行培养。常用的选择培养基为HAT培养基，它是用次黄嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶配制的。其中氨基喋吟(A)能阻断DNA合成的主要途径，瘤—瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾—脾融合细胞和瘤细胞在这样的组织培养条件下，几天内亦迅速死亡。由于骨髓瘤细胞都是次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此脾—瘤融合的杂交瘤细胞可利用HGPRT酶，用次黄嘌吟(H)和胸腺嘧啶合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。在最适的培养条件下．大约有105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活。在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞。所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。一般认为饲养细胞能释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，故应用的较多。3、筛选阳性克隆与克隆化常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释...