·科研简报·脊髓TNFα、IL-1β和IL-6在神经病理性疼痛过程中的表达变化钟敏1曾因明2柳垂亮1招伟贤1(1广东省中医院麻醉科,广州510120;2徐州医学院江苏省麻醉医学研究所,徐州221002)近年研究表明,外周与中枢免疫系统的激活参与了神经病理性疼痛的过程,其中细胞因子是联系神经-免疫反应的关键分子。尽管对细胞因子在神经病理性疼痛中的作用进行了大量研究,但研究结果尚有分歧[1]。由于不同的细胞因子在病理性疼痛中的作用可能不同,并且细胞因子的表达时间特点依赖于不同的动物模型和测定的组织类型和部位[2]。本文采用大鼠坐骨神经慢性压迫损伤模型,探讨了脊髓中TNFα、IL-1β和IL-6在神经病理性疼痛过程中的表达变化。材料与方法1.实验动物和分组选用健康成年雄性SD大鼠,实验前体重250±20g,由徐州医学院实验动物中心提供。饲养3天以适应环境后,随机分为假手术(sham)组和CCI组,分别于术前和术后1,3,7,11,14,21天进行行为学测定,于术前,术后1,7,14和21天取腰段脊髓进行相关检测。每组每个时间点各取6只大鼠。2.坐骨神经慢性压迫损伤(CCI)模型的制备[3]戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射后,选择左侧后肢,消毒皮肤,切开皮肤,分离皮下及肌肉,暴露坐骨神经,以3.0丝线相隔1mm松结扎4道,至神经外膜稍稍受压为止,打结时可见左下肢肢体轻微抽动,逐层缝合。对照组仅进行分离坐骨神经手术操作,不结扎坐骨神经。3.行为学测定按Chaplan[4]报道方法测定机械缩足反射阈值(mechanicalwithdrawalthreshold,MWT)。方法如下:置大鼠于透明的有机玻璃箱(22×12×22cm3)中,底为0.5×0.5cm2孔径的铁丝网。实验前使之适应15min。以不同折力(bucklingforce)的vonFrey细丝(Stoelting公司,美国)分别刺激大鼠足底。从2.0g开始,以upanddown法推测阈值,在阈值上下各刺激5次,用内推法算出50%反应阈值(即引起5次试验中2.5次反应的值)。最大折力为15g,大于此值时记为15g。每次试验至少间隔15s,并等刺激引起的行为反应(如舔足等)完全消失后再给予下一次刺激。4.细胞因子IL-1β、IL-6和TNFαmRNA的测定采用荧光定量PCR技术。由Genebank数据库中获得基因序列,采用PrimerExpress软件进行计算机辅助设计,TaqMan荧光探针(TM)根据定量PCR仪的滤光片波长选择FAM作为荧光报告基团,TAMRA为淬灭基团。引物和探针由上海生工生物公司合成,以GAPDH为内参基因。序列如下:TNFα上游引物5'-AGACCCTCACACTCAGAT-CATCTTC-3',下游引物5'-CTCCGCTTGGTGGTTT-GCTA-3',探针5'-FAM-AGTGACAAGCCCGTAGC-CCACGTC-TAMRA-3',扩增长度81bp;IL-6上游引物5'-ATATGTTCTCAGGGAGATCTTGGAA-3',下游引物5'-TGCATCATCGCTGTTCATACAA-3',探针5'-FAM-TGAGAAAAGAGTTGTGCAATGGCAATTCTG-TAMRA-3',扩增长度78bp;IL-1β上游引物5'-GCACCTTCTTTTCCTTCATCTTTG-3',下游引物5'-CACACTAGCAGGTCGTCATCATC-3',探针5'-FAM-AGCCCGTCCTCTGTGACTCGT-TAMRA-3',扩增长度75bp;GAPDH上游引物5'-CCGAGGGCCCACTA-AAGG-3',下游引物5'-GCTGTTGAAGTCACAG-GAGACAA-3',探针5'-FAM-CATCCTGGGCTACACT-GAGGACCA-TAMRA-3',扩增长度65bp。5.细胞因子IL-1β、IL-6和TNFα蛋白的测定采用双抗体夹心ELISA法,按试剂盒说明进行操作。6.统计学处理数据以均数±标准差(X±S)表示,组间比较采用t检验,组内比较采用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.行为学观察两组大鼠术后健康状况良好,体重无明显减轻,觅食饮水基本正常。CCI组大鼠均出现术侧后爪轻度内收,后爪外翻和跛行,经常患足悬空或不敢着地,悬空时间有时超过25s;站立时·42·中国疼痛医学杂志ChineseJournalofPainMedicine2010,16,(1)以健肢持重,患肢抬起并紧贴于腹部;但未发现自噬肢体的现象。两组间MWT基础值无显著性差异。坐骨神经压迫损伤术后1天,CCI组大鼠MWT即显著降低(P<0.01)。与术前及sham组比较,CCI组大鼠MWT持续降低至术后21天(P<0.01)。2.细胞因子IL-1β、IL-6和TNFαmRNA的表达变化CCI组TNFαmRNA起始模板量于术后1天开始升高,并且高于Sham组(P<0.05);术后7天为术前的2.2倍(P<0.05);14天时下降,21天时基本回到基础水平。CCI组IL-1βmRNA起始模板量于术后1天时为术前的4.4倍,并且高于Sham组(P<0.05);术后7天进一步升高,为术前的5.7倍(...
