第l3卷第l2期2003年6月中国现代医学杂志ChinaJournalofModemMedicineV_DI．13No．12】m．2003核桃楸青果皮等浸出物对小鼠巨噬细胞内一TNF基因表达的影响第四军医大学吉林军医学院生理教研室(吉林132001)姜丽萍北华大学医学院血液教研室常殿武傅桂连长春中医学院梁志彬·论著·目的：确定小鼠应用核桃楸青果皮等浸出物后腹腔巨噬细胞内TNFa—mRNA表达的变化。方法：雌雄小鼠随机分组。口服给药后制备巨噬细胞涂片；克隆hTNFcDNA的PGEM—l质粒转化EeoliJM103。选择阳性克隆细胞培养扩增；随机引物法制备地高辛标记的探针；利用原位杂交技术检测巨噬细胞内TNFa—mR．NA的表达。结果：抗肿瘤核桃楸青果皮等浸出物可增强小鼠腹腔巨噬细胞内TNFa—mRNA表达。结论：本项目研究揭示了抗肿瘤中草药核桃楸青果皮等浸出物用于抗肿瘤的作用机理。关键词核桃楸青果皮TNF原位杂交分类号R979．1THEEIECToFGREENPEELHICKoRYNI兀EXTRACTIoNoN1匝1【]Fh—GENEEXPRESSIoNINPERITONEALMROPHAGE0FMI(：EJiangLiping，ChangDianwu，FuGuilian，eta1．DepartmentofPhysiology，JilinMilitaryMedialCollege，FourthMilitaryMedialUniversity，Jilin132001[Abstract]Obj~tive：TodetectthechangesofTNFa—nlRNAexpressionintheperitonealmacrophageofmicethattooktheextractivesofgreenpeelofhickorynut、Method：Maleandfemalemiceweredividedatrandomintogroups．theextmctivesofgreenpeelofhickorynutwasorallygivenandthenSImearsofmacrophagealiceswerepre·pared．PlasmidofpGEM—1whichcontainedbTNFq—cDNAWastransformedintoECellJM103。bacteriaw骶selectedandcultured．TheexpressionofTNFa—mRNAinmacrophagesdetectedwithhybridizationinsitu、Re-．suits：TheextmctivesoftheChinesemedicinecanpromotetheexpressionofTNFa—mRNAinperitonealmacrophageofmice．Conclusion：Themethodofmolecularbiologycanbeusedtoshowthemechanismofanticuringcancerbyextmctlvesofgreenpeelofhickorynutetcsomechineseberhalmedicine．Keywords：GrenPeelofHickorynut；TNFa；HybridizationinSitua一肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor—a)是由巨噬细胞产生，对癌细胞有特异性杀伤作用，而对机体的正常细胞无损害的一种活性蛋白质【1．2】。美国Genentech公司于是1984年首次分离获得了这一蛋白并制备获得了表达人的TNFcDNA。1985年将其基因产品TNFa用于临床治疗。但是，应用吉林省教育厅科研基金资助项目，编号9956基因工程产品的TNFa治疗肿瘤无疑是很昂贵的。因此，我们利用分子生物技术，来寻找到具有同基因工程产品TNF相同作用的中草药，为恶性肿瘤的病人提供一种价格低，且疗效好的药物。我们在对小鼠应用核桃楸青果皮浸出物作用后，利用原位杂交技术检测小鼠腹腔巨噬细胞中·32·维普资讯http://www.cqvip.com第12期姜丽萍，等：核桃楸青果皮等浸出物对小鼠巨噬细胞内a—TNF基因表达的影响TNFa—mRNA含量的变化。实验结果证明核桃楸青果皮浸出物对TNFa的转录具有较强的促进效应。1材料和方法1．1材料DEPC(焦炭酸二乙酯)，多聚赖氨酸，SDS，Sepharose2B，为Sigma产品，多聚甲醛，甲酷胺，为Fluka产品，限制性内切酶为Promega产品，DigRNA标记试剂盒(SP6／T7)Cat，No117502，Anti．digOxigenin—APFabfragmentCat，No1093274，为德国宝灵曼产品。1．2方法1．2．1小鼠口服核桃楸青果皮水浸物实验动物及分组：采用白求思医科大学实验动物部饲养的正常小白鼠。雌雄随机抽样，体重为1820g，实验组9只，对照组8只。1．2．2药品及给药核桃楸青果皮(GreenpeelOfWalnutChinesecatalpa)按常规煎制浓缩含生药0．2g／ml，小鼠按每公斤体重0．4ml／kg口服给药，连服10d，每日1次。对照组口服生理盐水。1．2．3小鼠腹腔巨噬细胞的制备在猝死之前24h，腹腔注射1％可溶性淀粉后，取5ml1604培养液腹腔注射，猝死。抽取腹水约2ml，离心1000rpm／min，3mln，弃上清，加适量1640培养液制成细胞浓度为1×10个／ml，待细胞涂片用。1．2．4探针制备感受态大肠杆菌的制备和转化：主要依据Sambrook等人的方法[】制备感受态大肠杆菌...
