花生过敏原Ara h2.02的克隆、表达及免疫学鉴定VIP免费

收稿日期:2010�06�27;*通讯联系人.基金项目:国家自然科学基金(30871752),深圳出入境检验检疫局科技计划(SZ2008105),深圳市深港创新圈和深圳大学创新团队基金资助项目.作者简介:易海涛(1984�),男,湖北广水人,硕士研究生,主要从事医药生化与分子生物学方面的研究.文章编号:1000�5862(2010)05�0531�05花生过敏原Arah2.02的克隆、表达及免疫学鉴定易海涛,�刘志刚,�闫�浩,�刘�芳,�赵郭存,�夏立新*(深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所,广东深圳�518060)摘要:通过提取花生总RNA,设计特异性引物,RT�PCR克隆花生Arah2.02基因,将反转录的基因连入pMD19�TSimpleVector,提质粒酶切鉴定并测序,将测序正确的片段连入原核表达载体pET�32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中,IPTG诱导表达、Western�blotting检测该重组蛋白的免疫原性.测序结果表明:克隆的花生Arah2.02基因片段全长为519bp,编码为172个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同.诱导表达后的蛋白经SDS�PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符.Western�blotting结果表明该蛋白能与花生过敏病人混合血清中的IgE结合,具有免疫原性.成功克隆并表达了花生过敏原Arah2.02,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性.关键词:花生;过敏原;Arah2.02;克隆;表达;免疫印迹中图分类号:Q785�����文献标识码:A过敏性疾病被世界卫生组织列为21世纪重点防治的3大疾病之一,是当前世界性的重大卫生学问题,世界各国过敏反应性疾病的总发病率高达10%~30%,此类型疾病包括食物过敏、过敏性哮喘和过敏性鼻炎等,是临床上的常见病、多发病[1�2].世界粮农组织(FAO)1995年报告,90%以上的食物过敏是由牛奶、鸡蛋、鱼、贝壳海产品、花生、大豆、坚果类和小麦引起[3].食物中能使机体产生过敏反应抗原分子称为食物过敏原,它们大多为蛋白质[4�5].据报道,花生过敏占食物过敏的10%~47%[6],因此花生蛋白是重要的食物过敏原.花生是�90年代中国食物结构改革与发展纲要中提出的重点开发利用植物蛋白之一.随着国民饮食结构的变化,花生消费将不断增加,花生过敏发病率可能会呈上升的趋势.重组过敏原是当今乃至未来变态反应学的重要研究方向[7].目前国际免疫联合会命名小组委员会认可的花生过敏原有11种[8],其中Arah2是一种主要的花生过敏原,超过90%的花生过敏患者血清IgE都能够识别Arah2[9].大量研究表明:Arah2包含有2个亚型,分别为Arah2.01和Arah2.02,与过敏原Arah2.01相比,Arah2.02多1个IgE结合表位,因此其致敏性可能更严重[10].本文成功克隆表达出花生Arah2.02蛋白,并对该蛋白进行免疫学鉴定,为花生过敏的临床诊断和治疗奠定了生物学基础.1�材料与方法1.1�材料和试剂1.1.1�材料�花生从深圳市南山区学府路人人乐超市购买;所用花生过敏患者的10份阳性血清以及3份阴性对照血清取自于海口市人民医院(经UnitCAP检测,二级以上);大肠埃希菌(E.coli)Top10和BL21(DE3)由深圳大学过敏反应与免疫学研究所提供.1.1.2�试剂�RNA提取试剂盒购于德国Qiagen公司,cDNA合成试剂盒(AMVfirststrandcDNAsynthesiskit)购于美国BioBasicInc.(BBI)公司.克隆所用的特异性引物由华大基因合成;琼脂糖凝胶回收试剂盒[GelEx�第34卷第5期2010年9月�江西师范大学学报(自然科学版)JOURNALOFJIANGXINORMALUNIVERSITY(NATURALSCIENCE)Vol.34No.5�Sep.2010tractionKit(50)D2500�01]以及质粒小量提取试剂盒[PlasmidMiniKit!(100)D6943�01]均购于美国OMEGA公司;克隆载体pMD19�TSimpleVector、表达载体pET�32a(+)、LA�TaqDNA聚合酶、限制性内切酶EcoR!和Hind∀、T4DNA连接酶以及DL2000DNAMarker均购于宝生物工程(大连)有限公司(Takara);羊抗人二抗IgE购于美国KPL公司.1.2�方法1.2.1�引物的设计合成�从GenBank上下载花生Arah2.02的核酸序列,利用GeneTool软件设计并合成特异性引物(由华大基因合成):上游引物为5#CGgaattcATGGCCAAGCTCACCATACTAGTA3#;下游引物为5#CCCaagcttTTAGTATCTGTCTCTGCCGCCAC3#,其中分别插入EcoR!(gaattc)和Hind∀(aagctt)酶切位点以及保护碱基(CG)和(CCC).1.2.2�花生Arah2.02基因的RT�PCR扩增�取2粒饱满的花生于液氮中充分研磨,取约100mg于RNaseFree离心...