中山医科大学学报990204中山医科大学学报ACADEMICJOURNALOFSUNYAT-SENUNIVERSITYOFMEDICALSCIENCES1999年第20卷第2期Vol.20No.21999肝豆状核变性病基因突变分析徐评议梁秀龄马少春摘要：目的：寻找中国人肝豆状核变性病(WD)基因突变的形式及频率。方法：应用PCR-SSCP法对45名WD患者进行基因exon5、8、14、18筛选，对确定异常者进行DNA序列分析。结果：在45名患者DNA样本的PCR扩增产物中未发现exon18泳动异常，而3名患者显示exon14多态性泳动异常，但这种泳动也可见于正常标本中。4例患者显示exon5单链构象多态性，序列分析表明为T插入突变，其突变频率为8.89%；2例存在exon8泳动异常，序列分析表明该外显子同时存在770codonC2250→G同义突变和G2273→TArg778→Leu错义突变，其突变频率为4.44%。结论：不同功能区域的exon5及exon8外显子突变可能是中国人WD发病的原因。主题词：肝豆状核变性/遗传学；DNA突变分析中图号：R742.4AnalysisofGeneMutationofWilsonDiseaseXuPingyiLiangXiulingMaShaochun(DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversityofMedicalSciences,Guangzhou,510080)AbstractObjective:ToinvestigatethestyleandfrequencyofgenemutationinChinesepatientssufferingfromWilsondisease(WD).Method:PCR-SSCPwasusedtoscreeninexon5,8,14,18ofWDgenefor45WilsondiseasepatientsandDNAsequencewasanalyzedtoabnormalgenebandsidentifiedbypolyacrylamidgelelectrophoresis.Results:In45PCRproductsofWDDNAsamples,nomobilitychangewithexon18wasfoundinsinglestrandconformationpolymorphismanalysis,but3mobilitychangewithexon14wasdetected,butthismobilitychangewasalsodetectedinPCR-SSCPanalysisofnormalDNAsamplesandalso4mobilityshiftwasdetectedinexon5.ThereisanewTinsertioninexon5byDNAsequenceanalysis.Themutationfrequencyis8.89%,andwealsodetected2mobilityshiftinexon8,andaffirmedthatthereisasamesensemutationC2250→Gon770codonwithamissensemutationG2273→TonArg778→Leutogetherintheexon,themutationfrequencyis4.44%.Conclusion:Thesefindingsindicatedthatthemutationofexon5andexon8indifferentfunctionalareasofWilsondiseasegenemaybethecauseofthediseaseinChinesepeople.Subjectheadingshepatolenticulardegeneration/genetics;DNAmutationalanalysisfile:///E|/qk/zsykdxxb/zsyk99/zsyk9902/990204.htm（第1／5页）2010-3-2322:15:47万方数据中山医科大学学报990204近年来国内外学者相继开展肝豆状核变性病(Wilsondisease,WD)的分子生物学研究。WD基因已定位和克隆［1～5］，其基因表达产物为一种与铜离子转运有关的ATP酶(ATP7B)。迄今为止，国外学者已报道WD基因至少存在95种突变［6］，形式多为单碱基置换、插入或几个碱基丢失，其中欧洲人基因突变的特点为exon14和exon18，发生错义突变的频率分别高达28%和10%，而国内关于中国人WD基因突变的正式文献尚未见报道。本文报告采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)、聚合酶链反应-DNA(PCR-DNA)直接测序法对45个WD患者基因进行exon5、8、14、18突变分析的结果。1材料与方法1.1DNA标本收集收集15例无亲缘关系正常个体和45例来自全国各地已确诊的WD患者外周抗凝全血5mL，经酚—氯仿抽提法提取白细胞DNA。正常个体标本由中山医科大学附属第一医院血库提供。WD患者经本科确诊，具有典型锥体外系症状和体征，角膜K-F环阳性以及血清铜蓝蛋白水平低下，24h尿铜含量升高等生化特征。1.2基因突变筛查的PCR-SSCP法WD基因exon5、8、14、18扩增产物及条件如表1。25μLPCR反应体系中，含1μLDNA样品，20pmol引物，1×PCR缓冲液，0.2mmoldNTP，1UTaq酶(PE公司)；97℃变性10min；94℃30s，退火50s，72℃60s，循环35次，最后72℃延伸10min：扩增产物经10g/L普通琼脂糖电泳鉴定后，按文献［7］方法稍作改良进行SSCP分析。PCR产物8μL加8μL甲酰胺变性剂(950g/L去离子甲酰胺，3g/L溴酚蓝，3g/L二甲氰醇)，97℃变性5min，-20℃立即冷却，上样60g/L或80g/L的聚丙烯酰胺凝胶中...
