实验一真核细胞染色体DNA的分离、纯化和检测实验目的实验目的通过实验学习从血液中制备染色体通过实验学习从血液中制备染色体DNADNA的方的方法。法。学习琼脂糖凝胶电泳，检测学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNADNA的纯度、的纯度、DDNANA的构型、含量以及分子量的大小。的构型、含量以及分子量的大小。掌握掌握DNADNA样品的纯化和定量检测方法。样品的纯化和定量检测方法。红细胞裂解液裂解红细胞红细胞裂解液裂解红细胞细胞裂解液裂解白细胞细胞裂解液裂解白细胞用蛋白酶用蛋白酶KK水解蛋白质水解蛋白质有机溶剂酚、氯仿抽提有机溶剂酚、氯仿抽提在高盐条件下，用乙醇沉淀在高盐条件下，用乙醇沉淀DNADNA再用再用70%70%乙醇洗除沉淀中的盐分乙醇洗除沉淀中的盐分即可获得染色体即可获得染色体DNADNA实验原理实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。实验原理实验原理纯净的纯净的DNAA260/A280=1.8DNAA260/A280=1.8，制备的，制备的DNADNA样品应该为样品应该为1.7~1.1.7~1.88纯净的纯净的RNAA260/A280=2.0RNAA260/A280=2.0，制备的，制备的RNARNA样品应该大于样品应该大于2.02.0如果制备的如果制备的DNADNA样品样品A260/A280<1.7A260/A280<1.7，说明样品中含酶和蛋，说明样品中含酶和蛋白质过高，应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉白质过高，应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀淀DNADNA；；A260/A280>2A260/A280>2，说明样品中，说明样品中RNARNA过高，可用过高，可用RNaseRNase消化后，消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNADNA；；如果样品如果样品A260/A280A260/A280为为1.8~2.01.8~2.0，说明样品中盐的含量过高，，说明样品中盐的含量过高，样品沉淀后应用样品沉淀后应用70%70%乙醇多洗一遍。乙醇多洗一遍。提取的提取的RNARNA样品样品A260/A280A260/A280应大于应大于1.801.80。。RNARNA样品含有蛋白样品含有蛋白质会使质会使A260/A280A260/A280比值下降。比值下降。实验原理实验原理实验材料实验材料红细胞裂解液KHCO31g(10mM)NH4Cl8.3g(155mM)EDTA·Na237mg(0.1mM)裂解缓冲液（lysisbuffer）10mMTris-Cl(pH8.0)0.1MEDTA(pH8.0)0.5%(m/v)SDSACD抗凝液柠檬酸0.48g柠檬酸钠1.32g右旋葡萄糖1.47g加水至100ml,使用时每6ml新鲜血液加1mlACD液组织细胞动物血液样品，将20ml新鲜血液与3.5mlACD抗凝液混匀，0℃下保存数天或-70℃下长期冻存，备用。酚：氯仿：异戊醇（酚：氯仿：异戊醇（2525：：2424：：11））70%70%乙醇乙醇琼脂糖琼脂糖TAETAE电泳缓冲液电泳缓冲液电泳设备电泳设备紫外分光光度计紫外分光光度计凝胶成像系统凝胶成像系统实验材料实验材料染色体染色体DNADNA的制备方法的制备方法1.取800μl抗凝血液置于5ml离心管中。2.往管中加3ml红细胞裂解液，轻摇数次，置冰上5分钟，期间间歇摇动几次。3.4000rpm，室温离心5分钟，弃上清。4.往管中加入3ml红细胞裂解液，重悬沉淀，冰上5分钟，期间摇几次。5.4000rpm，离心5分钟，弃上清。6.重复步骤4、5四至五遍，至出现明显白色沉淀。7.用1×PBS重悬白色沉淀。8.4000rpm，离心5分钟，弃上清。9.每管中加入500μl白细胞裂解缓冲液（每小组配制1ml)，重悬细胞，加入20μlproteinaseK（20mg/ml），混匀后转移至1.5ml离心管，置55℃水浴1小时。10.加入酚：氯仿500μl，盖紧后上下颠倒几次10000rpm，离心5分钟，取上层水相，至1.5ml离心管，加入氯仿500μl，盖紧后上下颠倒几次10000rpm，离心5分钟，取上层水相至5ml离心管。（两次取上清前用剪刀将枪头尖剪去3mm)11.加入1ml无水乙醇,可见混浊，盖紧后上下颠倒混匀...
