灵芝多糖的结构特征分析VIP免费

DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00372灵芝多糖的结构特征分析何晋浙邵平孟祥河孙培龙*(浙江工业大学生物与环境工程学院食品系，杭州310032)摘要采用沸水回流法从灵芝子实体中提取多糖，经Sevage法除蛋白，乙醇沉淀，离心、透析、膜分离，浓缩、冻干后得灵芝多糖。经HIO4氧化、Smith降解及甲基化反应，并利用多糖及刚果红混合液在碱性溶液中的波长的红移变化，通过UV-VIS，IR，GC，GC-MS，NMR对灵芝水提多糖的结构特征及三螺旋体结构进行分析研究。结果表明:灵芝多糖含有三螺旋体构型，GC-MS分析灵芝多糖的主要单糖组分为葡萄糖，还有少量的半乳糖、甘露糖、木糖和艾杜糖，IR及1HNMR分析多糖为β-构型，HIO4氧化、Smith降解和甲基化分析表明:多糖主要为(1→3)糖苷键连接构型，并伴有少量的1→6位支链键连接的结构，灵芝多糖是由D-葡萄糖单元通过β-(1→3)糖苷键连接葡聚多糖，其主要构型特征为(1→3)β-D-线性连接的骨架结构。关键词灵芝多糖;结构特征;β-葡聚糖;三螺旋体2009-07-05收稿;2009-09-29接受本文系国家高技术研究发展计划863计划(No.2007AA10Z337)和浙江省科技厅项目(No.2008C32030)资助*E-mail:sunpeil@163.com1引言灵芝是中国名贵的中药材，具有滋补强身、扶正固本、轻身延年之功效，属多孔菌科类真菌［1］，其水提物的主要活性组分是多糖。近年来，越来越多的研究表明，真菌多糖具有强烈的抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、降血糖及免疫活性作用［2］。而真菌多糖的生物活性与多糖的结构存在重要的构效关系［3］。目前，虽然对灵芝多糖的活性研究报道较多，但对其多糖结构作全面深入的分析研究报道鲜见。蒋志国等［4］采用高速逆流色谱方法分离纯化香茹中的多糖;孙元琳等［5］采用红外光谱和GC方法分析当归多糖水解后的单糖组成。本研究主要对赤灵芝多糖结构进行提取与纯化，采用膜分离，并经HIO4氧化及甲基化反应，通过紫外可见光谱(UV-VIS)、红外光谱(IR)、气相色谱-质谱(GC-MS)、核磁共振(NMR)对灵芝多糖三旋螺旋体结构及多糖的结构特性进行了全面的分析研究，以促进灵芝多糖的药理作用及其构效关系的研究。2实验部分2.1仪器与试剂Labscale小型切向流超滤系统(美国Millipore公司);UV2450紫外分光光度计(日本岛津公司);Nicolet6700型红外光谱仪(美国尼高力公司);6890N气相色谱仪(美国Agilent公司)，DB-1701毛细管色谱柱;FinnigantraceDSQII气相色谱-质谱联用仪(美国热电公司)，DB-1色谱柱;ANANCEⅢ500M核磁共振仪(瑞士Bruker公司)。三氟乙酸、赤鲜醇、岩藻糖、阿拉伯糖为进口试剂，其余单糖与试剂均为国产分析纯试剂，Sevage试剂为氯仿-正丁醇(4∶1，V/V)混合溶液。2.2实验方法2.2.1多糖的提取与纯化灵芝子实体为灵芝(金华寿县谷药业有限公司提供)。灵芝子实体切片后粉碎，分多次称取60g，按料液比1∶10在微沸状态下回流2h，取上清液，残渣反复提取3次，合并上清液，真空浓缩。并以Sevage法除蛋白，在每100mL浓缩液中加20mLSevage试剂，剧烈振荡30min，以4000r/min离心15min，取上清液，加无水乙醇至溶液含量达95%，静置过夜，收集沉淀物。再依次用95%乙醇、乙醚、丙酮洗涤各两次，得粗多糖。再用蒸馏水溶解，经Millpope超滤器和采用10K膜包蒸馏水透析8h，分别取10，30，50和100K膜包下截流组分，浓缩、以乙醇沉淀提取，冷冻干燥制得灵第38卷2010年3月分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry第3期372～376芝多糖。2.2.2甲基化反应以改良Hakmori法进行多糖甲基化反应［6］。经P2O5充分干燥的15mg灵芝多糖样品置于反应瓶中，在充N2及磁力搅拌下，以6mL除水的二甲亚砜(DMSO)充分溶解多糖样品，加入240mgNaOH，搅拌30min，在室温下避光过夜，随后置于冰浴中，缓慢加入3.6mLCH3I，在常温超声浴中反应8min后，通N2驱赶剩余的CH3I，重复2次甲基化，12KMWCO透析袋流水透析24h，浓缩和冻干，至多糖甲基化，IR图谱在3400cm－1处无羟基吸收峰。2.2.3多糖乙酰化反应在6mg甲基化多糖样品中加入2mL甲酸，100℃密闭水解6h，减压蒸发至干，再加入4mL2mol/L三氟乙酸，110℃密闭水解6h，减压蒸发至干，加3mL甲醇，减压蒸发至干，如此重复3次。溶解于5mL蒸馏水...