作者单位:210002南京军区军事医学研究所(朱敏生、潘英、许祥裕、沈月);南京儿童医院神经外科(王刚、范毓华);美国西南医学中心(智刚、KimSLau、JamesTStull)·论著·正常肌肉和Duchenne肌营养不良肌肉中脑型一氧化氮合酶mRNA及其蛋白表达量的研究朱敏生潘英王刚许祥裕范毓华沈月智刚KimSLauJamesTStull【摘要】目的检测正常人与Duchenne肌营养不良症(DMD)患儿肌肉中脑型一氧化氮合酶(nNOS)mRNA及其蛋白的表达水平。方法建立高敏感性的RNA酶保护实验,并通过Westernblot分析的方法,对10例DMD肌肉标本和5例正常儿童肌肉标本中nNOSmRNA及其蛋白表达情况进行检测。结果DMD患儿肌肉中nNOSmRNA的表达量只有正常肌肉的10%,nNOS蛋白亦有相同的表达规律。结论nNOS蛋白在DMD肌肉细胞和肌膜上呈低含量,是由于nNOS在转录水平上合成减少所致。【关键词】一氧化氮合酶;RNA,信使;肌营养不良DifferentialexpressionofnNOSmRNAandnNOSproteininnormalandDuchennemusculardystrophicmusclesZHUMinsheng3,PANYing,WANGGang,etal.3NanjingMilitaryInstituteofMedicalSciences,Nanjing210002,China【Abstract】ObjectiveTocomparetheexpressionlevelofneuronalnitricoxidesynthase(nNOS)mRNAandnNOSproteininnormalandDuchennemusculardystrophy(DMD)muscles.MethodsTheauthorsdevelopedmodifiedhighlysensitiveRNaseprotectionassayandwesternblotassay,andtherebydeterminednNOSmRNAanditsproteininskeletalmusclesof10DMDpatientsand5normalcontrolchildren.ResultsTheresultsshowedthattheexpressionofnNOSmRNAinDMDmuscleswasonly10%ofthatinnormalmuscles.Accordingly,nNOSproteinexpressionlevelinDMDmuscleswasalsosignificantlylowerthanthatinnormalmuscles.ConclusionThedecreaseofnNOSproteininskeletalmusclesofDMDpatientsmaybeduetolowexpressionofnNOSmRNAattranscriptionlevel.【Keywords】Nitric2oxidesynthase;RNA,messenger;MusculardystrophyDuchenne肌营养不良症(Duchennemusculardystrophic,DMD)是一种常见的儿科遗传病,主要病因是由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)先天缺陷[1,2]。主要病理过程为肌肉纤维进行性萎缩变性,坏死和脂肪填充。dystrophin是一个膜结构蛋白,近年来发现它能与脑型一氧化氮合酶(neuronalnitricsynthase,nNOS)通过GLGF氨基酸序列相结合,并将nNOS锚定于肌膜上。当dystrophin缺乏时,这种结合丧失或减弱[123],此时,nNOS仅存在于肌纤维胞质中,有人认为这种游离形式的nNOS可能与DMD损伤有关[4]。但人们又发现在mdx小鼠(已先天剔除dystrophin)的肌肉中,不但nNOS在肌膜上消失,而且nNOSmRNA也逐渐减少[5]。这就提示游离形式的nNOS亦会随之减少,难以成为DMD损伤的重要因素。由于动物模型和人往往存在着多方面的差别,在人DMD肌肉中nNOS的表达情况如何是值得探讨的问题。由于nNOSmRNA在组织中的丰度很低且标本取材受限,测定其mRNA水平较难。我们通过改良,建立了高敏感性的RNase保护实验,成功地比较了nNOS蛋白和mRNA在正常儿童和DMD肌肉中表达水平,为研究nNOS在DMD损伤中的作用提供了依据。材料和方法一、材料1.主要酶、蛋白、DNA及试剂:各种分子生物学工具酶购于Promega公司、华美试剂和Fluka公司;地高辛标记的RNA合成混合物、碱性磷酸酶标记的·001·中华儿科杂志2000年2月第38卷第2期ChinJPediatr,February2000,Vol38,No.2抗地高辛抗体和酶底物购于宝灵曼公司;Zeta尼龙膜购于BioRad公司;大肠杆菌tRNA、硫酸葡聚糖、甲酰胺购于华美公司,其他试剂购于Sigma公司和国产分析纯试剂。2.质粒和细菌:pCMV/nNOS:由美国西南医学中心KimSLau提供,该质粒含有大鼠nNOS的全长cDNA。pGEM3z购于Promega公司;pGEM/actin质粒由智刚教授提供;JM109细菌由本室保存。3.肌肉标本来源及临床资料:10例DMD腓肠肌标本均来源于南京市儿童医院,年龄4～12岁,男性。经临床诊断,病理活检和肌电图诊断为DMD,5例正常儿童腓肠肌标本分别为南京市儿童医院和江苏省人民医院正常的外伤儿童的新鲜标本。二、方法1.PCR、体外转录等基本操作按分子克隆手册[6]进行。2.RNA的提取:采用一步法[7]提取RNA。3.改良RNase...
