膜蛋白的提取与分离VIP免费

膜蛋白的提取与分离膜蛋白的分离一、简介：1细胞质膜资料1895年Qverton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成II。1925年Gorter&Grendel:用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出："细胞膜是由双层脂分子组成"。1935年Danielli&Davson：从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三明治结构模型"，即蛋白质一脂-蛋白质。1959年Robertson:用电镜观察生物膜提出"单位膜模型”，将膜的分子结构与超微机构统一起来厚度：2(暗)+3.5(亮)+2(暗)=7.5细胞质膜的主要功能概括如下：(1)为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境；(2)选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；(3)提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；(4)为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；⑸介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接；质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。2膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。(1)外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。⑵内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可分离出来。获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。附注：使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，仍然是蛋白组学的一个瓶颈，不管采用2—D技术也好，ICAT乃至proeinmicroarray都还不能有效解决这一问题。二、蛋白抽提三、谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解度也各不相同•根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取.四、但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS（—种离子去污剂），Emulgen和Lubrol等表面活性剂。五、1、分离膜蛋白的方法（原则性）：六、1）先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。（例如：michaelll液氮研磨组织,加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收集37%与41%间的成分，即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白）七、2）用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定•去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤•虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂•这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题•如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠•许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂•然而，他们并不是普遍适用的•在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质•如tritonX-100在280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂.八、将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来•这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入•使用这种方法所获得的膜蛋...