DNAzyme核酶简介VIP专享VIP免费

1982年，美国科学家T.Cech在研究中发现了核酶（ribozyme）,自身剪接内含子的RNA具有催化功能［1］。这揭示了酶不仅有蛋白一种组成形式，也有可能是核酸。无独有偶，GeraldJoyce在1994年发现了脱氧核酶（DNAzyme），可以催化单个核糖核苷酸磷酸酯的Pb2+依赖性切割［2］。迄今为止已经发现了数十种DNAzyme。DNAzyme一般是通过SELEX体外筛选技术获得。下面以RNA切割活性的DNAzyme为例，简单介绍体外筛选的过程。如图1所示，用于筛选的DNA文库包含一段60个随机碱基的部分（图中绿色部分），两侧是能与PCR产物结合的序列（黑色部分），PCR产物结合序列的上游包含RNA位点，作为DNAzyme的底物。在文库DNA的5'端修饰有生物素，与链酶亲和素结合从而固定在固相表面。金属离子存在时，小部分文库DNA序列可以折叠形成带有酶活性的结构，切割RNA位点，这部分文库得以从固相表面释放下来。切割下来的产物通过两轮PCR进行富集，第一轮PCR扩增全长序列，第二类PCR通过引物再次引入RNA位点和生物素标签。通过5~10轮的重复直到文库达到饱和。接下来对文库测序以鉴定出那些活性最高的序列［3］。根据催化功能的不同,可以将DNAzyme分为5大类：RNA切割活性的DNAzyme、DNA切割活性的DNAzyme，具有连接酶功能的DNAzyme，过氧化物酶活力的DNAzyme，修饰胸腺嘧啶二聚体的DNAzyme［4］。下面分别介绍这五类DNAzyme。1.RNA切割活性的DNAzyme这类DNAzyme是发现最早，也是研究的最深入的一类DNAzyme。比较早被研究的是8-17和10-23两种DNAzyme，它是在1997年由SELEX（指数富集的配基系统进化技术）发现的，命名来源于体外筛选的过程，8-17是筛选过程的第8轮的第17个克隆获得，而10-23是筛选过程的第10轮的第23个克隆获得［5］。如图2所示为8-17和10-23两种DNAzyme的结构。其中反义链为DNAzyme链，正义链为DNAzyme的底物链，两者通过碱基互补配对形成部分双链的结构。DNAzyme在未配对的位置形成一个环状结构，是其进行催化反应的中心。DNAzyme催化箭头所示位置核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂，形成3'端带有2'，3'-环磷酸结构和5'端带有羟基的两条核苷酸链［3］（图3）。Recoerution2.CleavageMO+图3:RNA切割活性的DNAzyme的切除产物2.DNA切割酶活性的DNAzyme脱氧核酶不仅仅对RNA有活性,在一定的条件下也可以完成DNA的切割。在铜（II）离子和抗坏血酸钠（SA，Sodiumascorbate）存在的条件下，Cu-DNAzyme可以对图4箭头所示位置的G碱基位置的磷酸二酯键发生断裂，而二价的铜（II）离子也被还原成一价的铜（I）离子。如果体系中存在组氨酸，则铜（II）离子会与组氨酸形成配合物，无法发生DNA切割反应［6］。OfOCu(IQOCu(l)Histidine图4:Cu-DNAzyme的断裂原理FMT1THCu-EnzymeCu^Su3.连接酶活性的DNAzymeCuenoud等［7］筛选到了一个4nt具有DNA连接酶活性的DNAzyme,命名为E47。图4所示的实验首先利用有RNA切割活性的DNAzyme将01链切断，得到O2链，接下来在E47的催化作用下，O2与另一条DNA链O3完成链接，得到O4链。这里之所以不能使用O1经过RNA切割活性的DNAzyme剪切得到的另一条核酸链，是因为另外一条核酸链的3'端经过剪切后得到的是2'，3'-环磷酸结构，E47无法进行催化。此外，用于连接的O3需要使用咪唑和EDC将3'端的磷酸进行活化，E47所催化的是5'端羟基与3'端的磷酸（咪唑活化）之间的连接。ByDNAzymesggpotwact加Pratem/RNA-free图5:DNA连接酶活性的DNAzymeE47的连接过程也有DNAzyme催化RNA的3'-5'连接过程。镁离子依赖的9DB1和锌离子依赖的7DE5都可以催化这一反应，底物RNA链的5'端需要进行三磷酸化，这种三磷酸化的RNA链可以通过使用T7RNApolymerase进行体外转录得到［8］。图6:RNA连接酶活性的DNAzyme4.过氧化物酶活性DNAzyme如果DNA内部含有G-四联体结构如图6中的PS5.ST1它可以催化铜离子（II）和锰离子（II）这些二价的金属离子结合到卟啉环上形成金属配合物。PS5.ST1的鸟笼状G-四联体结构包裹Hemin（高铁血红素，图中橙黄色菱形部分）后具有过氧化物酶活性，在过氧化氢存在的情况下，催化ABTS底物形成蓝绿色的反应产物［9］。图7:过氧化物酶活性DNAzyme5.修复胸腺嘧啶二聚体的DNAzymeSen等［10］筛选到了筛选...