1实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色一、实验目的和内容（一）实验目的1.复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。2.初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤（二）实验内容1．学习油浸系物镜的使用方法。2．制作细菌染色装片。3．进行革兰氏染色法操作。4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。二、实验原理（一）油镜的基本原理普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneousimmersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberalaperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。图1-1显微镜物镜参数图显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。影响数值孔径大小的因数，一是2镜口角，二是介质的折射率。当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。（二）革兰氏染色革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。三、实验材料和用具1.菌种大肠杆菌(Escherichiacoli)、苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)。2.试剂革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等）、香柏油、二甲苯。3.仪器及用具显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。四、操作步骤(一)细菌的革兰氏染色1.制片（1）涂菌用无菌操作方法从平板中沾取菌苔一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（2）干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥（温度不宜过高）。（3）固定将细菌涂片向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色。32.染色（1）初染于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。（2）媒染滴加卢戈氏碘液，1min后水洗。（3）脱色滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)，立即水洗。（4）复染滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。（5）镜检用滤纸吸干，油镜镜检。（二）镜检1.观察前的准备（1）将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。坐正。（2）调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。观察染色装片时，光线宜强；观察未染色装片时，光线不宜太强。2.低倍镜观察染色装片首先上升镜筒，将细菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至装片0.5cm处，适当缩小光圈，然后...
