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分子生物学常用技术PCR产物A-T克隆测序重组表达载体重组蛋白制备抗体转染细胞原核表达载体真核表达载体病毒表达载体昆虫表达载体酵母表达载体检测活性体内、体外作用机制应用(1)PCR(2)核酸的纯化：凝胶回收Kit(3)连接反应：16℃过夜/222h℃(4)CaCl2法制备感受态细胞：Kit(5)宿主菌的转化及蓝白筛选(6)挑克隆：2ml含抗生素的LB(7)提质粒：Kit(8)重组质粒的鉴定：双酶切反应、菌落PCR(9)测序：生物技术服务公司(10)菌种保存:20~30%甘油-LB，-20/-70℃步骤：(11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染(12)目的基因表达的鉴定：RT-PCR、NorthernBlot、原位杂交、SouthernBlot(13)目的蛋白表达的检测：原核表达：SDS-PAGE(重组蛋白诱导表达的诱导剂浓度、诱导时间和温度、重组蛋白表达的形式)、WB真核表达：WesternBlot、ELISA、免疫组化(14)重组蛋白的纯化：亲和层析，His-tag/GST-tag(15)制备抗体：多抗和单抗(16)基因功能检测：提高/降低表达水平细胞周期检测：流式细胞仪细胞增殖检测：MTT细胞凋亡检测:流式细胞仪、TUNEL、DNALadder抑瘤活性检测：体外、体内对血管化的影响。。。。。。。(17)作用机制1.PCR：Pfu,加A尾；[1208/8:00]2.Agarose电泳：Goldview染色;[1208]3.核酸纯化：凝胶回收Kit;[1208]4.Agarose电泳：检测回收条带;[1208]4.连接反应：pGMT,22℃2h;[1208]5.转化：Top10,热激法，蓝白筛选。[1208]实验一1.挑克隆：2ml含抗生素的LB+1个克隆；[1209/9:00]2.提质粒：Kit；[1210/8:00]3.重组质粒的鉴定：双酶切反应，37℃2h；[1210]4.Agarose电泳：Goldview染色；[1210]5.测序和序列比对：生物技术服务公司；[1213]6.菌种保存:20~30%甘油-LB，-20/-70℃。[1215]实验二实验三1.转化：BL21,热激法；[1208]2.挑克隆：2ml含抗生素的LB+1个克隆；[1209/9:00]3.转接：1%过夜菌+2ml含抗生素的LB,2管;[1210/8:00]4.诱导：0.5mM和0.1mM的IPTG（终浓度）;[1210]5.碎菌：超声处理;[1215/8:00]6.SDS-PAGE：10%分离胶，考兰染色，脱色。[1215]实验四1.SDS-PAGE：10%分离胶；[1215]2.转膜：湿转；[1215]3.封闭：RT1h；[1215]4.Ab1：4℃过夜；[1215]5.Ab2：RT40min；[1216/8:00]6.ECL：RT5min；[1216]实验XXX1.设备：加样器2.耗材3.试剂和配制方法：详细4.步骤：详细1.核酸的分离纯化和鉴定:基因组DNA、总RNA、质粒2.基因的克隆与鉴定方法3.外源基因转移技术和表达体系4.检测方法：电泳技术：agarose、SDS-PAGE分子杂交:SB、NB、WB、基因芯片技术DNA序列测定生物信息学分析技术5.基因功能研究的方法6.组学研究技术：基因组学、蛋白质组学内容’核酸的基本组成AlbrechtKossel1910年诺贝尔生理或医学奖揭示核酸的化学成分“其对蛋白质，包括核物质的研究工作为我们了解细胞化学作出了贡献”Lord(AlexanderR.)Todd核苷酸的基本结构1957年诺贝尔化学奖“核苷和核苷辅酶”1962年诺贝尔生理或医学奖FrancisHarryComptonCrickJamesDeweyWatsonMauriceHughFrederickWilkins“发现核酸的分子结构及其对于生命物质信息传递的重要意义”DNA分子的二级结构5’末端(游离磷酸基)3’末端(游离羟基)数量庞大dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)3’，5’-磷酸二酯键(共价键)直线形多聚体方向:5’---3’，5’CAG…..3’特点DNA半保留复制变性与复性变性：指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂，不引起分子量降低。一、核酸的分离、纯化和鉴定1.基因组DNA的分离、纯化：PCR、Southern-blot、构建基因组文库实验材料：哺乳动物组织(50~100mg)哺乳动物细胞(5x105~107)六孔板/T25实验步骤：RT匀浆：TEpH8.0组织(液氮冻存、研磨)消化：EDTA、SDS、蛋白酶K、RNase、37/55℃℃抽提：酚、氯仿、异戊醇沉淀：异丙醇/NaAc+无水乙醇洗涤：75％乙醇干燥：风干溶解：TE/H2O注意事项：(1)试剂：pH值准确(2)蛋白酶K：20mg/ml，分装，-20℃，避免反复冻融(3)抽提：完全，不要触及蛋白层(4)干燥：避免过分(5)操作：小心，机械剪切作用，80~100kb2.总RNA的分离纯化:略3.质粒：细菌等微生物细胞染色体以外，能独立进行复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学性状的共价闭环双链DNA分子。合格质粒的组成要素复...