抑制破骨细胞生成及拮抗小鼠卵巢切除诱导骨量丢失 (1)VIP免费

1引言骨稳态环境的动态平衡是破骨细胞的再吸收和成骨细胞的不断生成共同维系的结果(1,2)，过度的破骨细胞活动会导致骨质疏松等骨代谢疾病(2)。骨质疏松症被认为是一种以骨量减少、骨组织构造异样、骨脆性及骨折增多为特性的慢性病症现已变成世界性的公共卫生难题(3)。当前世界有10.2亿左右的人口罹患上骨质疏松病症，预计到2030年，人数将增加至13.6亿(4)。OPG/NF-κB激活RANK/RANKL复合物应是一个在骨新陈代谢中起极其重要调节作用的子系统，调控成骨细胞介导的骨基质制备以及破骨细胞介导的骨吸收进展的动态平衡(5)。RANKL是一种与骨代谢有着密切联系的细胞因子，积极参加到破骨细胞的动态形成过程中，推动破骨细胞的成熟与分化(6)。RANKL-RANKL复合物（RANKL受体）可以引发调节因子（如TRAF6基因）的秩监测分离及其随后的MAPK激活(7,8)，从而上调NFATc1和c-Fos的表达水平，诱导破骨细胞的发生(9)。OPG应是由成骨细胞分泌的可溶性蛋白质，借助和RANKL竞争结合的手段而进一步提高骨密度，达到抑制骨吸取的最终目标(10)。RANKL/OPG的值能视为骨量与骨质安全的极其重要指标(11)。因而，由RANKL管理控制的信号源通路可以成为骨细胞的生物降解等病症的药理靶点(12)。抗过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）的药物因其阻碍多种癌细胞生长的巨大潜力而成为众多课题研究的对象。PPAR-γ不仅介入到成骨细胞的生成过程中(13)，同时其在破骨细胞中的表达水平也可以被彻底上调(14,15)。PPAR-γ被公认为外源性药物的药理靶点(16)，因为PPAR-γ特异性抑制剂导致骨吸收，从而导致骨吸收的增加(17,18)。虽然在目前的一些研究工作中报道，PPAR-γ在破骨细胞诱导骨病变病理生理中的作用尚不清楚，尚待进一步阐明。T0070907（T007；PubCheM数据库SID：53790303）已被发现并证明是PPAR-γ的有效和高特异性的竞争对手(19)。以往的体外研究表明T007对PPAR-γ有抑制作用(20)。此外，T007还具有抑癌特性(21,22)。例如，先前有研究显示T007调节PPAR-γ的表达以阻碍乳腺恶性肿瘤的发育和活力(21)。并且，T007以PPAR途径(23)作为细胞粘附和侵袭的抑制剂，在特定肝癌细胞系中诱导失巢凋亡。鉴于1上述PPAR信号通路的调节特性，我们推测该基因可能代表了克服骨代谢疾病的新方法。因此，我们的目的是探讨T007对破骨细胞的作用特性，尽可能破译T007介导的破骨细胞发生机制，并用小鼠卵巢切除模型检测T007对骨质疏松症骨丢失的治疗作用。2硕士学位论文正文材料与方法2材料与方法2.1实验材料2.1.1主要实验试剂与材料试剂生产厂家α-MEMR&D重组小鼠RANKL、MCSFR&DFBS美国Gibco-BRLCCK-8日本DojindoMolecularT0070907SelleckChemicals抗体（PPAR-γ、β-tubulin）Abcam公司抗体（NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG、GAPDH、β-actin）CSTChIP试剂盒CSTDNA质粒Genechem公司小干扰RNAGenechem公司RNA提取试剂盒Genechem公司荧光定量PCR试剂盒Genechem公司PCR引物Genechem公司无水乙醇、氯仿、异丙醇、BCIP/NBT、RIPA缓冲液、Trizol康为世纪Lipofectamine3000InvitrogenPVDF膜杭州弗德ECL化学发光试剂杭州弗德TRAP、茜素红染色试剂盒Sigma维生素CSigmaβ-glycerophosphateSigma3硕士学位论文正文材料与方法2.1.2主要仪器设备仪器生产厂家-80℃超低温冰箱Thermo细胞培养箱Thermo细胞培养用超净台ThermoNanoDrop2000分光光度计Thermo7500定量实时PCR扩增仪ABI台式离心机Heraeus高分辨Micro-CT机瑞士ScancoMedical2.2实验方法2.2.1原代细胞的分离提取与培养1.骨髓巨噬细胞（BMMs）：把6周龄左右大小的雌性C57BL/6小鼠,将其处死，在将整个小鼠置于75%乙醇中浸泡5分钟后取出，放在培养皿（10cm）中。用已经完成灭菌的医用剪刀等器械将小鼠股骨和胫骨取下并尽量剔除附着的肌肉组织。用1xPBS溶液清洗后，一手持眼科镊夹持股骨或胫骨，另一只手用医用眼科剪刀剪断股骨或者胫骨的两端，然后吸取1mlα-MEM完全培养基（10%血清+1%青霉素/链霉素+30ng/mLM-CSF），将骨髓血冲出到10cm培养皿中反复吹打混匀，48小时后放置在37°C、5%CO2的培养箱中培育。2.骨髓间充质干细胞（BMSCs）：取雌性C57BL/6小鼠（约2-4周龄）颈椎脱臼处死，将整个...