PCR 反应程序 1．常规程序 将 PCR 反应所需的成分配置完后，在 PCR 仪上于 94-96℃ 预加热几十秒至几分钟，使模板 DNA 充分变性，然后进入扩增循环
在每一个循环中，先于 94℃ 保持 30 秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般 50-60℃ 之间），一般保持 30 秒钟，使引物与模板充分退火；在 72℃ 保持 1 分钟（扩增 1kb 片段），使引物在模板上延伸，合成 DNA ，完成一个循环
重复这样的循环 25～35 次，使扩增的 DNA 片段大量累积
最后，在 72℃ 保持 3-7min ，使产物延伸完整， 4℃ 保存
2．复性（退火）和延伸温度 复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60℃ 之间
具体的温度主要由引物的 Tm 值决定
延伸温度绝大多数设定为 72℃
如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法 PCR
3．反应时间 变性步骤一般使用 30 秒钟，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长
复性时间有 30 秒种一般是足够的
延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间
4．循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为 104～105 数量级时，循环数通常为 25～35 次
平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象
原因：底物和引物的浓度已经降低， dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底
5．PCR 反应液的配制 PCR 反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行
常规方法与其它酶学反应一样，在最
