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引物纯化方式选择指南2012-2-16 10:24:14 内容导读一、 DNA 合成的方法和原理二、引物纯化的方法原理及其效果三、纯化方法与应用指南四、常见问题的原因分析及相应的对策一、 DNA 合成的方法和原理目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。基于该方法的DNA 合成仪有多种， 由 ABI/PE公司生产的高通量DNA 自动合成仪得到了广泛的应用。各合成仪进行引物合成的原理基本相同，主要区别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。生工公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪。固相亚磷酰胺三酯法合成DNA 片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA 链的合成的， DNA 化学合成不同于酶促的DNA 合成过程从5’ →3’方向延伸，而是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3’→ 5 ’磷酸二酯键连接。具体的反应步骤如图一。1、脱保护基(Deblocking) 用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT ( 二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。2、活化(Activation) 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其 3'-端已被活化，但5'-端仍受 DMT 保护 )，此中间体将与GPG 上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。3、连接(Coupling) 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG 上已脱保护基的核苷酸时，将与其 5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。4、封闭(Capping) 缩合反应后， 为了防止连在CPG 上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N- 甲基咪唑等混合形成的。图 1: DNA合成原理示意图（固相亚磷酰胺三酯法）5、氧化(Oxidation) 缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG 上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG 的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5'- 羟基上的保护基团DMT 后，重复以上的活化、连接、封闭、 氧化过程即可得到 DNA 片段粗品。 最后对其进行切割、脱保护基， 合成的 Oligo 在脱去保护基后，目的 Oligo纯度是比较低的，其中含有...