PCR的发明原理及应用VIP免费

PCR的发明、原理及应用PCR的发明KaryB.Mullis，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法DNA双螺旋结构于1953年发现第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合酶于1956年分离成功自1970年代起，由于发现选择性切割DNA分子的限制性内切酶及接合酶，可将DNA分子加以重组，因此引发了基因工程的开展•1983年春，Mullis发展出PCR的概念；•1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；•1984年11月，用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的第一个PCR片断；•1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；•1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。•1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；•1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，TaqDNApolymerase，这是86年春天Mullis建议做的；•1988年，第一台PCR仪问世；•1991年，HoffmanLaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。PCR的原理PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：1.模板DNA的变性：即在高温（93℃左右）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；2.模板DNA与引物的退火(复性)：在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3.引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的5’→3’方向延伸，合成DNA新链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。PCR反应五要素：即参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模板、和Mg2+。（一）Mg2+:终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与TaqDNA聚合酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2+能影响反应的特异性和产率。（二）dNTP：dNTP具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。（三）TaqDNA聚合酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为70～75℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。（四）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。（五）引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。引物GC约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。PCR常见问题1、模板原因①纯度：含有抑制物②浓度：含量低or太高2、引物原因①引物错误②引物设计不好③引物合成、纯化不好3、PCR条件原因①退火温度②延伸时间③循环次数4、非特异性扩增或拖尾①引物特异性差②模板和引物浓度过高③酶量过多④Mg2+浓度偏高⑤退火温度偏低⑥循环次数过多PCR的应用基因、DNA片段的克隆人工基因构建DNA序列测定基因定点突变基因型（突变）检测SNP分析，遗传背景分析生物物种...