实时荧光定量PCR 技术的原理及应用(图) 一、实时荧光定量PCR 原理（一）定义：在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。（二）实时原理1、常规 PCR 技术：对 PCR 扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。2、实时定量PCR 技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过 Ct 值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念：（1）扩增曲线：（2） 荧光阈值：（3）Ct 值：CT 值的重现性：5、定量原理：理想的 PCR 反应：X=X 0*2 n非理想的 PCR 反应：X=X 0 (1+Ex) nn：扩增反应的循环次数X：第 n 次循环后的产物量X 0：初始模板量Ex ：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的C(t) 值2）通过标准曲线由未知样品的C(t) 值推算出其初始量7、DNA 的荧光标记：二、实时荧光定量PCR 的几种方法介绍方法一： SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA 的小沟部位 2、SYBR Green 只有和双链DNA 结合后才发荧光3、变性时， DNA 双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA ， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。PCR 反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度 :太高抑制 Taq 酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer ：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2 的浓度 :可以降低到1.5mM, 以减少非特异性产物4、反应 Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规PCR 相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、 基因型的分析；3、 融解曲线分析： 可以优化 PCR 反应的条件， 对常规 PCR 有指导意义， 如对 primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。（三）优点及缺点优点：对 DNA 模板没有选择性；适用于任何DNA ； 使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。缺点：容易与非特异性双链DNA 结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。方法二： TaqMan--- 水解型杂交探针**5 ′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如 FAM 、VIC 等**3 ′端标记有荧光淬灭基团(Quenche...
