REAL-TIME 引物设计与是否跨内含子的检测方法 1.丁香园子里最详细的检测引物是否跨内含子的流程 2.提供多图显示如何找到基因外显子与内含子 3.如何最简便设计跨内含子的引物（利用primer-blast） 感谢隔壁的山西人提出这个问题，以及丁香园，google，百度，PUBMED 提供解决问题的方法和线索供我拼凑整理。 问题一：如何在 pubmed 上找到目标基因的DNA 序列以及其内含子和外显子情况。 步骤： 打开 NCBI 主页面，选 GENE，输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因（fig.1）-》找到你要的种属，打开-》显示基因信息，找到”Genomic regions, transcripts, and products”,点击基因名称，links到geneback（fig.2）-》显示了该基因DNA 的信息(fig.3),可以看到这是基因组 DNA,从 mRNA 选项中可以看到JION 后面的是外显子的位置，该基因一个共有 3 个内含子，4 个外显子，以及外显子的起至位置，为了以后的操作，可以把这个DNA 序列和外显子的起至位置记下来。 Fig.1 0 Fig.2 0 Fig.3 0 问题二：如何在pu bmed 上找到目标基因的mRNA 序列。 步骤：打开 NCBI 主页面，选 GENE，输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因-》找到你要的种属，打开-》显示基因信息，找到“mRNA and protein”前面那个 NM***********,号码（fig.4），把它记下来（后面的blast 要用）并点开-》显示这个基因的mRNA 信息(Fig.5)，最后的ORIGIN 是 CDNA 序列，把它记下来，一会 PRIMER 的时候要用。 Fig.4 0 Fig.5 0 问题三：如何设计跨内含子的引物（利用primer-blast） 1）打开primer-blast 网站 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/） 2）将mRNA 编号（NM***********）输入序列框中，real time PCR 一般产物长度为80～150bp 也可以超一点，但是会影响扩增效率，这样就不能用ddCT 法计算了，酌情考虑。温度在 55～63 和 GC 含量在 40%～60%，两条链不要差太远。点击GET primer 详细的设计方法可以参看http://ask.bbioo.com/ask/show-2362.html 3)会得到若干条引物（fig。6），红条中的黄圈标记的小白色缺口是内含子所在的位置，跨过小缺口就是跨了内含子。 根据下面列出的引物具体的温度GC 含量之类的再进行选择 4）将初步选择的引物用PRIMER 5 验证引物二聚体，发卡结构等，方法见下个问题“问题四：用PRIMER 5查找已知引物的产物位置” 引物设计原则见：h...
