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大量实验表明，针对同一靶基因的不同siRNA 序列具有不同的沉默效率，为了能够运用RNAi技术更有效地沉默靶基因，需要在RNAi 的第一步，也是其成功与否的关键环节―siRNA 序列的设计方面进行更多的改进。本文将在以下几个方面探讨 siRNA 序列设计方面的最新研究进展，作为应用RNAi 技术时的参考。 1 SiRNA序列的设计 RNAi 最终要通过 siRNA 片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA 序列，是决定 RNAi 特异性的关键所在，也是siRNA 设计的基本原则。从具有不同沉默效率的siRNA 序列中筛选出高效的siRNA 序列，需要经过严密的设计和不断的实验检验[1]。 1.1 siRNA序列在靶基因中的位置 从靶基因起始密码子 AUG下游 50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA 序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。以前的研究表明：不要以 5′非翻译区（5′UTR）和 3′非翻译区（3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计 siRNA 的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RISC竞争结合 siRNA 序列，降低RNAi 效应[3]；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性(SNP)区域。最近，Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中，5′UTR 是一个高度保守区，使之成为siRNA理想的靶点。运用RNAi 技术作用于 5′UTR 或 3′UTR 序列，同样可引起靶基因沉默[4,5]，这些发现使基因功能分析领域扩展到 5′UTR 和 3′UTR 内。 1.2 siRNA序列的起始碱基与长度 SiRNA序列最好为AA(N n)UU(N 代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29 nt之间)， NA(N n) UU 和 NA(N n) NN 序列也可以。以前的研究表明，典型 siRNA 的三大结构特征是：长度为21～23 nt；siRNA 双链的3′端各有两个突出碱基；siRNA 双链的5′端有磷酸基团。以 AA?N19 标准设计的siRNA，在哺乳动物细胞中 70%～80%可产生 RNAi 作用。但是一些具有较小脱靶效应的siRNA 序列不是以 AA 为起始的，所以现在不推荐以“AA 为起始”作为选择标准之一[6]。最新研究表明[7,8] ，27 nt或 29 nt的siRNA 与21 ntsiRNA相比：（1）其抑制活性可提高数倍以上；（2）不易于诱导干扰素反应和激活 PKR；（3）一些基因对21 ntsiRNA不敏感，但是可以被 27 ntsiRNA有效的抑制；（4）与21 ntSiRNA相比，27 ntSiRNA对靶基因的最大抑制率可在相对低的浓度下得到。另外，在...