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HBVDNA定量检测上海交通大学医学院刘湘帆讲师PCRPCR基因的原理基因的原理一、一、PCRPCR技术的发展及原理技术的发展及原理19711971年，年，KleppeKleppe等人首次在文章中准确、等人首次在文章中准确、客观地阐述了客观地阐述了PCRPCR方法。方法。19851985年，美国年，美国PE-CetusPE-Cetus公司的公司的KaryMullKaryMullisis等人发明等人发明PCRPCR技术。技术。PCRPCR原理原理PCRPCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链链DNADNA解开螺旋，在退火温度条件下引物解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板同模板DNADNA杂交，在杂交，在TaqDNATaqDNA聚合酶，聚合酶，dNTdNTPsPs，，Mg2+Mg2+和合适和合适pHpH缓冲液存在条件下延缓冲液存在条件下延伸引物，重复“伸引物，重复“变性→退火→引物延伸变性→退火→引物延伸””过程至过程至25-4025-40个循环，呈指数级扩大待测个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。样本中的核酸拷贝数。PCR的基本原理PCRPCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理PCRPCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理PCRPCR基因扩增仪工作关键是基因扩增仪工作关键是温度控制温度控制技术在技术在PCRPCR反应体系中加入特异性的荧光反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监测整个从而实时监测整个PCRPCR反应过程，最后通反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。过标准曲线对未知模板进行定量分析。荧光实时定量荧光实时定量PCRPCR（（real-timequantireal-timequantitativePCR,RQ-PCRtativePCR,RQ-PCR））荧光定量荧光定量PCRPCR（（fluorescencequantitativePCR,FfluorescencequantitativePCR,FQ-PCRQ-PCR），又称实时），又称实时PCRPCR，是目前较精确的进行，是目前较精确的进行定量定量检测检测PCRPCR的方法的方法FQ-PCRFQ-PCR通过荧光信号对通过荧光信号对PCRPCR过程中产物量进行实时监过程中产物量进行实时监测，测，精确计算出精确计算出PCRPCR的初始模板量的初始模板量荧光定量荧光定量PCRPCR是融合了是融合了PCRPCR高灵敏性、高灵敏性、DNADNA杂交高特异性杂交高特异性和和光谱分析光谱分析的精确性，直接检测扩增过程中双链的精确性，直接检测扩增过程中双链DNADNA荧光信号荧光信号的变化以获得定量的结果。的变化以获得定量的结果。系统内装置有半导体系统内装置有半导体PCRPCR、卤钨灯光源激发荧光信号、光栅、卤钨灯光源激发荧光信号、光栅分光、超低温光电耦合器（分光、超低温光电耦合器（CCDCCD）摄象机收集荧光信号、计）摄象机收集荧光信号、计算机软件分析系统等。算机软件分析系统等。荧光定量荧光定量PCRPCR检测的是检测的是样本的样本的初始浓度初始浓度，而准，而准确测定初始浓度需要在确测定初始浓度需要在对数期对数期进行。进行。Thesoftwaredisplaysthefluorescencesignalsinreal-timeimmediatelyaftereachmeasurement.Signalsfromthesamplesareobtainedasthemachinepositionsthecapillariessequentiallyovertheopticalunit.Duringthermalcycling,fluorescencecanbemeasuredoncepercycleforeverycapillaryandthefluorescencevaluesaredisplayedimmediatelyonthescreenandupdatedaftereverycycle(Fig.3).Thegenerateddataarestoredforfurtheranalysis.荧光定量PCR在每一次循环后对进行实时监控，因此能最准确反映出对数期。确定准确的初始浓度。软件系统可以进行参数设定、保存数据和报告结果，并将结果自动保存在计算机中。相同模板进行96次扩增的扩增曲线图。①①荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCRPCR扩增产物扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理...