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【原位杂交】专业010203目录实验原理实验步骤案例分析1010203目录实验原理实验步骤案例分析201实验方法3123原位杂交简介荧光原位杂交的简介原理详解图01实验方法一、ISH·全称：原位杂交（insituhybridization）·原理：将标记的核酸探针（miRNA，lncRNA，circRNA，DNA）与细胞或组织中的核酸进行杂交。·实验样本：组织/细胞·研究对象：组织或细胞·优点：特异性较强、灵敏度较高、快速简便，应用较广。401实验方法二、FISH·全称：Fluorescenceinsituhybridization，荧光原位杂交、·作用：检测核酸的表达量。·实验样本：组织/细胞·研究对象：组织或细胞·优点：特异性强、灵敏度高、快速简便，应用广。501实验方法原理：用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。60103目录实验原理参考范例702实验步骤02实验步骤812实验流程图实验步骤详解二、ISH及FISH——实验步骤流程图902实验流程探针变性标本变性杂交洗脱杂交信号的放大观察结果封片02将探针在75℃恒温水浴中温育5min，0℃5～10min，使双链DNA探针变性。①标本于50℃培养箱中烤片2～3h②浸在70～75℃70％甲酰胺的变性液中变性2～3min。③乙醇脱水，每次5min，然后空气干燥。（2）标本变性（1）探针变性（3）杂交将已变性或预退火的DNA探针滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上盖玻片，用Parafilm封片，37℃杂交过夜（约15～17h）。实验步骤①42～50℃的50％甲酰胺中洗涤3次，每次5min。②复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。（4）洗脱（5）杂交信号的放大①加封闭液I、avidin-FITC，37℃温育20min。②42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。③加封闭液II、antiavidin，37℃温育20min。④PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol，为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。（6）封片（7）荧光显微镜观察FISH结果先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。1002所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择荧光染料激光波长（nm）发射波长（nm）适用激发光FITC490520IBrhodamine511572IGTexasRed596620IYCy3515570B,BYDAPI345455UPI530615IB,G,IG1102实验步骤观察的方法透射电镜透射电竟相当于普通显微镜，只是用波长更短的电子束替代了会发生衍射的可见光，从而实现了显微。是二维的图象，会看到表面图象的同时看到内层物质。包括：大型透射电镜、低压透射电镜、冷冻电镜。扫描电镜是相当与对物体的照相，得到的是表面的。只是表面的立体三维的图象。因为扫描的原理是“感知”那些物体被电子束攻击后发出的次级电子。扫描电镜分辨率：0.18um可以观察活体细胞组织的动态变化，如：Ca2+、膜电位、PH值、跨膜运输等激光共聚焦显微镜1202激光共聚焦电子显微镜实验步骤1302实验步骤荧光三染CD68-巨噬细胞标志物iNOS-诱导性NOSDAPI-细胞核19SMA-647Catenin–568Actin-FITCMerged02实验步骤荧光四染SMA-647纤维细胞标志物Catenin–568钙黏蛋白Actin-FITC细胞骨架DAPI-细胞核200102目录实验原理实验步骤1603案例分析03案例分析1712如何撰写？参考文本1、总起句：说明研究的对象是组织还是细胞，目的是什么？使用试剂盒的一并说明例：采用FISH技术鉴定LINC01082在结肠癌细胞中的亚细胞定位。按照RiboTMlncRNAFISHProbeMix(Red)(锐博生物，中国)说明书操作。2、第二句开始描述具体方法如下：标本的制备及处理：在24孔培养板中放入盖玻片，取细胞按6×104/孔接种，使细胞融合率在80%左右；18如何撰写------原位杂交03案例分析细胞的固定：取出玻片，PBS清洗后加入1mL4%多聚甲醛室温固定，经蛋白酶K(2μg/mL)，甘氨酸，及乙酞化试剂处理杂交：加入250μL预杂交液，42℃孵育1h；探针处理：吸除预杂交液，加入250μL含有探针(300ng/mL)的杂交液，42℃杂交过夜；洗脱及染色：PBST清洗3次后，加入用PBST稀释的DAPI(1...