SRY基因的检测目的要求掌握PCR反应的基本原理掌握性别决定的分子机制掌握用PCR扩增检测性别的方法掌握用PCR扩增检测性别方法的应用原理1聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）的基本原理是，通过热变性使目的DNA（模板DNA）双链解开；通过退火将引物复性结合到它们的互补位置；通过DNA聚合酶延长引物，反复循环体外扩增出大量一对引物之间的DNA片段。聚合酶链反应PolymeraseChainReaction（PCR）一种可以将目的微量的DNA片断扩增100万倍以上的技术PCR可以把指定的基因片段指定的基因片段数量放大百万倍染色体Mullis(1993)PCR基本工作原理以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板3’和5’端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制延模板链延伸直至完成新的DNA合成。重复这一过程，可使目的DNA片段得以扩增。PCR体系基本组成成分含Mg2+的缓冲液dNTPs耐热DNA聚合酶TagDNA聚合酶特异性引物一对分别与待扩增DNA序列两端互补的寡核苷酸片段。模板DNA模板DNA基因组DNADNA样品待扩增片段PCR基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C循环25-30次使模板DNA完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除使引物和模板DNA退火结合此温度下DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA链的延长三个步骤为一个循环，每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环第一轮循环5/3/3/5/5/5/5/5/引物A引物B变性（95℃）6075859590807065555045403530℃退火（60℃）延伸（72℃）DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol温度温度第二轮循环5/5/5/3/3/5/5/5/引物A引物B6075859590807065555045403530℃变性（95℃）退火（60℃）延伸（72℃）5/5/5/5/温度温度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol第三次循环5/5/5/5/5/5/5/6075859590807065555045403530℃5/变性（95℃）退火（60℃）延伸（72℃）温度温度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol基因组DNADNA样品第一次循环第二次循环第三次循环第四次循环待扩增序列引物A引物B3/5/3/5/5/3/5/3/PCR的主要用途PCR的用途基因突变分析基因的体外突变目的基因的克隆DNA序列测定DNA和RNA的微量分析1、与反转录结合，直接从组织细胞中的mRNA获得目的基因；2、利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得目的基因片段；3、利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定序列相似性的基因片段；4、利用随机引物从cDNA文库中克隆基因。利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的DNA的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技术高度敏感，对DNA的含量要求很低。理论上只要存在一分子的模板就可以获得目的片段。RNA需要反转录。利用PCR结合其它技术，可以提高基因突变检测的敏感性。原理2人类个体的表型性别是由Y染色体决定的,具体地说是由Y染色体上编码睾丸发育的睾丸决定因子(testisdeterminingfactor,TDF)基因所决定，TDF基因的存在决定着睾丸的发育，即决定个体发育为男性。研究表明TDF基因位于Y染色体短臂与拟常染色体相接的35kb区域，该区域又称为Y染色体性别决定区（sexdeterminingregionoftheY，SRY）。。3在SRY基因区域设计特异的引物，如果能够利用PCR技术体外扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性。本实验在SRY基因区域内设计了一对引物，利用引物Y1.5/Y1.6扩增出一239bp的片段。4利用PCR技术扩增SRY基因片段检测性别具有广泛的实际应用价值，如结合细胞遗传学的核型分析，通过确认SRY所在区域的缺失或易位，诊断46，XY女性或46，XX男性性反转综合征的患者；通过检测胎儿的性别，预防甲型血友病、G6PD缺乏症等X连锁隐性遗传病患儿的出生；5通过骨髓移植后Y染色体特异的SRY基因片段的DNA分析是由阳性转为阴性或相反，来判断异性别的骨髓移植程度；多年尸块的DNA常有降解，而PCR只分析DNA的一小部分，不受降解的影响，因此本实验技术常应用于法医学上尸块或血斑的性别确定；此外，本实验还可用于需要快速、准确、同时需检查大量标本的运动员体检。一、由微量外周血标本制备模板DNA试剂与材料：1、细胞裂解缓冲液（SDS；蛋白酶K）2、酚：氯仿：异戊醇（25：24...
