慢病毒载体构建步骤研究VIP专享VIP免费

一、简介慢病毒（ Lentivirus）载体 是以 HIV-1 （人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。 区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。 该载体可以 将外源基因有效地整合到宿主染色体上 ，从而达到持久性表达。目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染 效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体 , 然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达 shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。在所构建的siRNA 表达载体中，是由RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ 有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA 不会带 poly A 尾。当 RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成 1~4 个U。U6 和 H1 RNA 启动子 是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～ 50ntRNA茎环结构（ stem loop ）。在siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA (small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和4～5T 转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个 U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA 。构建载体前通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入 siRNA表达载体（筛选...