抗氧化酶SOD、POD、CAT活性测定方法79498VIP免费

抗氧化酶（ SOD、 POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD ）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L 磷酸缓冲液 (PBS，pH7.8) ：A 母液： 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液: 取 Na2HPO4·12H2O（分子量 358.14）71.7g；B 母液： 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量 156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/L PBS （pH7.8）的配制：分别取A 母液 (Na2HPO 4) 228.75ml ，B 母液 (NaH 2PO4) 21.25ml ，用蒸馏水定容至1000ml。参考文献： 李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。（2）14.5mM 甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met 用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至 1000ml 。（3）30μ M EDTA-Na 2 溶液：取 0.001gEDTA-Na 2 用磷酸缓冲液定容至100ml 。（4）60μ M核黄素溶液：取0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（5）2.25mM 氮蓝四唑 (NBT) 溶液：取 0.1840g NBT 用 PBS 定容至 100ml，避光保存。酶液制备： 取 0.2g（可视情况调整） 样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液 （pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆， 转入离心管中在4℃、12000g 下离心 20min，上清液即为酶液。2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以 60 个样为准 )：分别取 Met 溶液 162ml，EDTA-Na 2 溶液 0.6ml ，磷酸缓冲液5.4ml ，NBT 溶液 6ml ，核黄素溶液6ml, 混合后摇匀；（2）分别取 3ml 反应混合液和30μl 酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux 光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1 支试管取3ml 反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1 支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后， 避光测 OD560( 出现颜色即可测定 )。（5）酶活性计算：SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原 50％所需酶量（ 测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为 1 个酶活单位（ u）。SOD 总活性＝[( A ck-A E ) ×V]/ （1/2A ck×W×Vt ）SOD 比活力＝ SOD 总活性 /蛋白质含量SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW ）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；A ck 为照光对照管的吸光度；A E 为样品管的吸光度；V 为样品液总体...