核酸的分离与纯化VIP免费

核酸的分离与纯化背景核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸提取也成为了分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。核酸提取亦是临床分子诊断最关键的操作，直接关系到实验的成败与否，是临床分子诊断容易发生问题步骤。核酸的存在形式DNA：细胞核DNP线粒体环状DNARNA：细胞质中，mRNA，rRNA，tRNA通常与蛋白质结合，形成RNP核酸的理化性质DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。核酸提取方法核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。核酸提取时应遵循以下原则:1、保证核酸分子一级结构的完整性;2、排除其他分子污染。核酸提取方法大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括：细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。核酸提取方法——细胞裂解细胞裂解可通过以下几种方法实现：物理作用化学作用酶作用（生物作用）核酸提取方法——细胞裂解——物理作用：包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。超声裂解法提取的核酸片段长度从<500bp到>20kb之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般<10kb。核酸提取方法——细胞裂解——化学作用：变性：加热、加入表面活性剂(SDS、TritonX-100、Tween-20、NP-40、CTAB、sar-cosyl、Chelex-100等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍)碱性pH环境：强碱(NaOH)或碱性缓冲液(TE、STE等)在一定的pH环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离子螯合剂(EDTA等)可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+、Ca2+,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。核酸提取方法——细胞裂解——酶作用（生物作用）：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)以使细胞破裂,核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1,4)键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65℃及有EDTA、尿素(1～4mol/L)和去污剂(0.5%SDS或1%TritonX-100)存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。核酸提取方法——酶处理在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解,以利于核酸的分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K或链酶蛋白酶)可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase和RNase)；或者加入DNase或RNase去除不需要的DNA或RNA。核酸提取方法——分离与纯化——酚氯仿法简介：1976，Stafford及其同事创立。现已经不断改进。关键技术：酚的使用用酚来分离核酸首先是Kirty，1956年首次报道。当时发现酚可以从水相中抽提蛋白质，使用阴离子盐时，可以实现核酸分配在水相，而蛋白质在有机相。核酸提取方法——分离与纯化——酚氯仿法核酸提取方法——分离与纯化——酚氯仿法◦酚的准备重蒸酚(去除可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联的醌类氧化物）；加入8一羟基喹咛，以防止酚氧化，（酚氧化发黄，而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联）；水饱和酚、平衡PH（大于7.8）（不饱和的酚能与15%其提及的水互溶，从而降低水相中核酸产量）◦发展和改进：SDS取代阴离子盐酚：氯仿混合液（增加了对糖、脂的溶解）异戊醇的使用（减少泡沫、使RNase失活）核酸提取方法——分离与纯化...