核酸环介导等温扩增技术原理及引物设计与实例1．LAMP 引物的设计：LAMP 引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的 F3c、F2c 和 Flc 区以及 5’ 端的 Bl、B2 和 B3 区等 6 个不同的位点设计4 种引物。FIP(Forward Inner Primer) ：上游内部引物，由 F2 区和 F1C 区域组成， F2 区与靶基因 3’端的 F2c 区域互补， F1C 区与靶基因 5’端的 Flc 区域序列相同。F3 引物：上游外部引物 (Forward Outer Primer) ，由 F3 区组成，并与靶基因的 F3c 区域互补。BIP 引物：下游内部引物 (Backward Inner Primer )，由 B1C 和 B2 区域组成，B2 区与靶基因 3’ 端的 B2c 区域互补， B1C 域与靶基因 5’端的 Blc 区域序列相同。B3 引物：下游外部引物 (Backward Outer Primer )，由 B3 区域组成，和靶基因的 B3c 区域互补。如图所示：2．扩增原理60— 65℃是双链 DNA 复性及延伸的中间温度 ，DNA 在 65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA 在此温度下合成是可能的。利用4 种特异引物依靠一种高活性链置换 DNA 聚合酶。使得链置换DNA 合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。第 1 阶段为起始阶段 ，任何一个引物向双链DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP 的 F2 序列首先与模板F2c结合（如图 B 所示），在链置换型 DNA 聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物 F3 与模板 F3c 结合并延伸，置换出完整的FIP 连接的互补单链（如图C所示）。FIP 上的 F1c 与此单链上的 Fl 为互补结构 。自我碱基配对形成环状结构 （如图 C 所示）。以此链为模板。下游引物BIP 与 B3 先后启动类似于FIP 和 F3 的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的 Fl 区段为起点．以自身为模板，进行DNA 合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP 基因扩增循环的起始结构。第 2 阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP 与茎环的 F2c 区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的 B1 区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．形成长短不一的2 条新茎环状结构的 DNA ，BIP 引物上的 B2 与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2 条环状引物 LF 和 LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置...
