植物原生质体分离、纯化与活力检测刘亚靖200911020 一. 实验器材：普通生物显微镜、移液枪及枪头、恒温水浴箱、离心机、pH 计、离心管、剪子、镊子、培养皿、烧杯、三角瓶、载玻片、盖玻片、镊子、血球计数板、酒精灯等。二. 试剂：(1) CPW溶液： KH2PO4 27.2 mg/L，KNO3 101mg/L，CaCl2·2H2O 148 0mg/L，MgSO4·7H2O 246 mg/L，KI 0.16 mg/L，CuSO4·5H2O 0.025 mg/L ，pH 5.6 。(2) 预处理液： 700 mmol/L 甘露醇 ( 约 13%甘露醇 ) ，用 CPW溶液配制。(3) 酶解液： 1%纤维素酶（ cellulase Onzuka R-10）、 0.1%果胶酶（ pectinase ）、 0.5%离析酶（ MacerozymeR-10）用洗涤液配制。(4) 洗涤液：含600 mmol/L 甘露醇 ( 约 11%甘露醇 ) 的 CPW溶液。(5) 原生质体染色贮液： 0.4% 的台盼兰（用洗涤液配制）。三. 实验材料：胡萝卜根皮层0.5-1.0 mm 。四. 实验程序与操作要点1. 原生质体的分离与纯化(1) 取胡萝卜根去表皮和里心0.4293 g ，置薄层预处理溶液中，室温黑暗下预处理1h。(2) 用吸管吸去预处理液，按材料：酶液=1：10 的比例加入4.3 mL酶解液，在26℃下保温黑暗酶解，其间不时轻轻摇动培养皿。(3) 酶解 2 h 后，取样在显微镜下观察到细胞壁的酶解情况，每0.5 h 观察一次，有圆球形原生质体释放到溶液中时即停止酶解。实际情况为未能观察到圆球形原生质体而一直未停止酶解。2. 原生质体的纯化由于纯化时的离心转速过大会导致原生质体破碎，故略过本步骤。 而实际情况是原生质体已经破碎，离心后破碎的是细胞器。3.原生质体活力测定台盼兰活体染色法：吸取纯化的原生质体悬浮液1 滴 于载玻片上中，滴加染料混匀在明视野显微镜下观察， 未被着色者为有活力的胡萝卜根皮层原生质体，深蓝色者是死细胞。实际情况为未染色者为有活力的细胞器，深蓝色者是死无活力的细胞器。4. 原生质体密度测定：用血球计数板在普通生物显微镜下直接计数，根据单位体积的细胞数计算细胞密度。实际情况为只观察到细胞器而未能进行细胞计数。五. 实验结果本次实验结果并不理想，由于酶解时间过长，且酶液浓度处于试验阶段，错过了最佳的原生质体释放时间， 导致后期观察到的均为细胞破碎之后内部的细胞器而并非分离出的原生质体。上图为 10*40 倍下仍很小的细胞器，而正确的实验结果应为10*4 倍下仍很大的圆球形原生质体，且原生质体内应有红色的胡萝卜素。六. 讨论与体会在...
