人类基因组DNA的提取与鉴定

实验一 人类基因组D N A 的提取与鉴定 实验目的 1、学习人类基因组DNA 的提取原理和方法。 2、熟悉应用分子生物学实验常用仪器。 实验原理 哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备 DNA，除特殊要求外，白血球、肝或脾组织是最常用的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA 提取方法大体类似，但都应考虑以下原则：（1）防止和抑制 DNase 对 DNA 的降解；（2）尽量减少对溶液中 DNA的机械剪切破坏，保持 DNA分子的完整；（3）将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。 制备基因组DNA 是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于 100-200kb。在 DNA 提取过程中应尽量避免使 DNA 断裂和降解的各种因素，以保证DNA 的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA 有 107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在 EDTA 以及 SDS 等试剂存在下用蛋白酶 K 消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA 不仅经酶切后可用于 Southern 分析，还可用于 PCR 的模板、文库构建等实验。 一、材料 一份提取总 DNA 的细胞或组织 1.5ml Eppendorf 管、微量移液器与吸头、15ml离心管、三角瓶（500或 1000ml）。 二、设备 离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或沸水浴、透射紫外灯。 三、试剂 1．细胞核裂解液(STE)：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA 2．0.8%（W/V）标准琼脂糖； 3．0.5×TBE 缓冲液 4．其他试剂：TE 缓冲液或重蒸水、氯仿/异戊醇（24:1，V/V）、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲液、溴化乙锭（EB） 四、操作步骤（酚法抽提染色体 DNA） （一）DNA 的提取 1. 采集口腔粘膜脱落细胞，用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm 离心10 分钟，倒掉上清；重复1 次。 2. 沉淀中加1ml 1×细胞核裂解液(STE)，混匀，再加350l STE 和 150l 10% SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10l 20mg/ml 蛋白酶 K，摇匀。37℃温箱过夜或 50℃ 3~4 小时。 3．加等体积饱和酚，轻摇混匀...