荧光定量PCR的原理使用

荧光定量 PCR 的原理及使用荧光定量 PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR 检测方法。其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链 DNA ，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法：1、双链 DNA 内插染料某些染料如 SYBR Green Ⅰ能选择性地与双链DNA 结合，同时产生强烈荧光。在 PCR 过程中 SYBR Green Ⅰ可与新合成的双链DNA 结合，产生的荧光信号与双链 DNA 成正比。SYBR Green I 荧光染料技术原理 SYBR Green I 是一种只与 DNA 双链结合的荧光染料。当它与DNA 双链结合时，发出荧光；从DNA 双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA 分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量 PCR的基本过程是：1、开始反应，当 SYBR Green染料与 DNA 双链结合时发出荧光。 2、DNA 变性时， SYBR Green 染料释放出来，荧光急剧减少。 3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR 产物。 4、聚合完成后， SYBR Green 染料与双链产物结合， 定量 PCR 系统检测到荧光的净增量加大。SYBR Green I 荧光染料与 DNA 双链的结合SYBR Green I 荧光染料能与所有的DNA 双链相结合，对DNA 模板没有选择性，所以特异性不如 TaqMan 探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对 PCR 引物设计的特异性和PCR 反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。2、TaqMan 探针技术原理TaqMan探针法是高度特异的定量PCR 技术，其核心是利用Taq酶的 3′ →5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量 PCR 反应体系中，包括一对 PCR 引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′ 端标记有报告基团 (Reporter, R)，如 FAM 、VIC等，3′ 端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)，如 TAMRA 等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。 随着 PCR的进行，Taq 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其 5′ →3′ 外切核酸酶...