经常有战友对一些常见问题在丁香园反复问答了很多遍，所以希望园子中一些战友，特别是低分与 0 分战友， 能将好的帖子归纳总结了一下，并结合自己的经验整理，一方面这是个学习提高的过程， 另一方面也能帮助大家解决这方面的问题。同时如有不当或不完善的地方， 希望各位战友不断补充， 争取有朝一日我们能把园子里战友的经验系统整理，给大家以帮助。我先把设计引物如何设计酶切位点这方面的帖子整理一下，因为昨天一下子看到三个相似问题。原帖如下：我想向你求教一个问题, 假如说我想把胰岛素基因和腺病毒载体连接起来 , 如何确定设计目的基因PCR时的引物呢 ?和相应的限制性核酸内切酶呢 ?谢谢老师能给予讲解 , 谢谢[ 整理 ] ：最初的时候， 由于害怕设计酶切位点最后切不开，所以经常采用最通用的方法，用 T 载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切， 所以感到还是直接扩增好一点。 但这就需要你仔细设计引物。 连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行 PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的， 可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录， 便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的， ，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。 我看 promega的说明书上说， 最好隔四个。 还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。最好使用酶切效率高的。最好使用双酶切有共同buffer的酶。最好使用较常用的酶（如hind3 ，bamh1，ecor1 等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。Tm的计算，关于 Tm的问题，很多的战友都有疑惑。 其实园子里有很多的解释了。Tm叫溶解温度（ melting temperature, Tm），即是 DNA双链溶解所需的温度。大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物...
