酵母单双杂交VIP专享VIP免费

酵母单、双杂交技术目录CONTENTS酵母单杂交技术2膜系统酵母双杂交技术3赛尔生物酵母单、双杂交技术服务5酵母单、双杂交在医学领域的应用4核系统酵母双杂交技术11酵母双杂交--基于GAL4的双杂交核系统Part酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，用来研究活细胞内蛋白质的相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也适用于高等植物蛋白质之间相互作用的研究。核系统酵母双杂交功能鉴定两个蛋白之间的相互作用发现新的与已知蛋白互作的蛋白确定蛋白相互作用的区域核系统酵母双杂交初识MATa型，筛选标记为：trp1，leu2报告基因为：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1由一些营养选择标记HIS3和(或)编码酶的基因IacZ基因组成，能显示“诱饵’和“猎物”相互作用的基因pGBKT7：筛选标志为Trp1，用于表达DNA-BD与Bait)的融合蛋白pGADT7：筛选标志为Leu，用于表达DNA-AD与Prey的融合蛋白MATα型，筛选标记为：trp1，leu2报告基因为：lacZ（对ß-gal显阳性）MEL1（对α-gal显阳性）Y187菌株Y2HGold菌株报告基因配套质粒核系统酵母双杂交报告株报告株指经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞,其作为报告株的酵母双杂交统具有许多优点：易于转化、便于回收扩增质粒具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合改造后的酵母细胞的特点:基因组中GAL4是缺失型的基因组中引入额外的报告基因Leu、Trp、His核系统酵母双杂交常用结构域DNA-BDYTH常用：GAL4系统DNA-AD真核细胞：GAL4系统(具有核定位序列)原核细胞：LexA系统(不具有核定位序列)GAL4、VP16、B42核系统酵母双杂交原理PromoterlacZ(orHIS)reportergeneGALUASTranscriptionDNA-BDDNA-ADBaitPreyDNA-BDDNA-ADDNA-BDBaitDNA-ADPrey文库构建流程＋＋dscDNAY187SD/-Leu筛选cDNA文库的评价及鉴定文库分装及冻存cDNA文库扩增目的基因合成目的片段与载体的连接大肠杆菌感受态的制备诱饵质粒构建流程诱饵质粒毒性及自激活验证菌液PCR鉴定核定位检测互作蛋白筛选流程1ML文库菌4ML诱饵菌混合培养杂交融合-二倍体筛选回转验证在细胞裂解物中，加入结合在固相支持物上的某种特异性抗体共孵育，该抗体就能够与其抗原形成免疫复合物。被抗体沉淀下来的靶抗原又在裂解液中共沉淀了一种结合伴侣蛋白。那些不能被沉淀下来的蛋白就会被洗涤走。然后进行SDS-PAGE和Westernblot分析。在co-IP中，当相关蛋白能够被共沉淀下来时通常假定这些蛋白在细胞水平上与靶蛋白的功能相关。免疫共沉淀的原理细胞裂解液与结合在固相支持物上的抗体共孵育互作蛋白CO-IP验证目的基因引物模板--回转验证阳性克隆质粒扩增目的基因pGBKT7-Myc-BaitpCDNA3.1-HA-Prey共转染CO-IP验证上拉下拉2酵母单杂交技术Part酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白质之间的相互作用，以研究真核细胞内的表达调控。酵母单杂交基本原理在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGla4结合位点。该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。靶DNA序列特异的结合蛋白(BDPX)与Gla4的激活结构域可融合形成融合体，BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。酵母单杂交基本原理诱饵（Bait）--DNA目的片段，或者一段诱饵序列，通过单拷贝或者随即拷贝克隆到pAbAi载体上，构建好的pBait-AbAi载体通过同源重组可高效整合到Y1HGold酵母菌株中，并产生诱饵特异性报告菌株。猎物(Prey)—猎物蛋白，被融合到含有酵母GAL4转录激活结构域（GAL4AD）表达载体中进行表达，通过共转化SMARTPCR扩增的cDNA和线性化pGADT7-Rec载体到酵母Y1HGold诱饵报告菌株中可以直接构建好酵母中的猎物文库。酵母单杂交原理将一至三个目的DNA重复序列克隆至pAbAi报告载体，然后整合到Y1HGold酵...