琼脂糖凝胶电泳VIP专享

一、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB) ，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。 一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在 0.2kb～50kb范围内的DNA片段。本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。 二、仪器及试剂 1.仪器及耗材： 水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、100 ml或 250 ml锥形瓶、量筒、吸头等。 2.试剂及配制： 50×TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0） 配制 1000 ml Tris 242 g 冰乙酸 57.1 ml 0.5 mol/L EDTA 100 ml 加入 600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至 1 L后。高温高压灭菌，室温保存。 1×TAE缓冲液的配制： 称量 20 ml的 50×TAE缓冲液，再加入 980 ml的去离子水。 溴化乙啶贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶 配制：100 ml 称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。室温保存。 6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。 配制：10 ml 溴酚蓝 25 mg 二甲苯青FF 25 mg 甘油 3 ml 用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。-20℃保存。 其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖、 三、操作步骤 1. 制备 1％琼脂糖凝胶(大胶用70ml，小胶用50ml)：称取0.7 g（0.5 g）琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml（50ml）1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸 3 次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。 2. 胶板...