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BrdU和MTT

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细胞增殖的检验方法:BrdU 标记法 1、细胞以1.5× 105 /ml 细胞数接种于直径35ml 培养皿中(内放置一盖玻片),培养1 天,用含0.4%FCS 培养液同步化3 天,使绝大多数细胞处于G0 期。 2、终止细胞培养前,加入BrdU(终浓度为30μg/L),37℃,孵育 40min。 3、弃培养液,玻片用PBS 洗涤 3 次。 4、甲醇/醋酸固定 10min。 5、经固定的玻片空气干燥,0.3%H2 O2 -甲醇 30min 灭活内源性氧化酶。 6、5%正常兔血清封闭。 7、甲酰胺 100℃,5min 变性核酸。 8、冰浴冷却后 PBS 洗涤,加1 抗即抗小鼠 BrdU 单抗(工作浓度1:50),阴性对照加PBS 或血清。 9、按 ABC 法进行检测,苏木素或伊红衬染,在显微镜下随机计数10 个高倍视野中细胞总数及 BrdU 阳性细胞数,计算标记指数(LI)。 BrdU 原理: 细胞增殖周期包括 G1、S、G2、M 4 个时期,其中S 期是 DNA 合成期,细胞内DNA 进行半保留复制,各种构成 DNA 的原料掺入到 DNA 中。 BrdU 作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物(其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与 5 位 C 原子连接的甲基被溴代替),像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA 中。当细胞处于DNA 合成期而同时又有 BrdU 存在时, 就会有BrdU 掺入新合成的DNA 中,只要细胞不消亡,这种BrdU 就在胞核的DNA 中长期存留。掺入到 DNA 的BrdU 可通过抗 BrdU 单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示。 该方法能对细胞周期进行迅速而稳定的测量, 而且标记BrdU 的细胞只要不受到紫外线照射,对细胞本身没有功能损害。 该技术可应用到跟踪检测移植细胞的存活、分化和功能状态。 MTT: http://w enku.baidu.com/view /6e6ec769a45177232f60a243.html (1)单细胞悬液接种于96 孔培养板;103-104 细胞/孔,每孔培养基总量200微升(96 孔培养板每孔容积370 微升),37℃、5% CO2 培养箱中培养一段时间(根据实验目的决定培养时间) (2)加入 2 毫克/毫升的 MTT 液(50 微升/孔);继续培养3 小时。 (3)吸出孔内培养液后,加入 DMSO 液(150 微升/孔),将培养板置于微孔板扳荡器上振荡 10 分钟,使结晶物溶解。 (4)酶标仪检测各孔OD 值(检测波长 570 纳米)。 MTT 溶液的配制方法 配制 MTT 时用 PBS(p h=7.4)溶解。PBS 配方:Nacl 8g + Kcl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g 调 p H 7.4,定容1L。...

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