第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备第一节杂交瘤技术的基本原理一、杂交瘤技术二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存第二节单克隆抗体的制备一、单克隆抗体的产生二、单克隆抗体的纯化三、单克隆抗体的性质鉴定四、单克隆抗体的特性第三节基因工程抗体制备一、人源化抗体二、小分子抗体三、抗体融合蛋白四、双特异性抗体五、噬菌体抗体库技术第四节单克隆抗体的应用一、检验医学诊断试剂二、蛋白质的提纯三、小分子抗体的应用四、抗体融合蛋白的应用五、双特异抗体的应用六、抗体库技术的应用和前景思考题小结第一节杂交瘤技术的基本原第一节杂交瘤技术的基本原理理杂交瘤技术原理：聚乙二醇（）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体抗体种类：第一代抗体多克隆抗体（)第二代抗体单克隆抗体（)第三代抗体基因工程抗体（)淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体流程一、杂交瘤技术不产生的重链和轻链与提供淋巴细胞的动物品系相同（一）小鼠骨髓瘤细胞动物：小鼠～周龄～体重（二）免疫脾细胞细胞性抗原：（）×只，不加佐剂，周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂微克抗原，周微克抗原，融合前天，加强免疫免疫小鼠。淋巴细胞。淋巴细胞发育。浆细胞。抗原接种培养液：培养液培养液（三）细胞融合细胞融合剂：:分子量的是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的，其纯度与毒性有所不同培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于℃或液氮及干冰中免疫脾细胞的制备：×的淋巴细胞无菌手术饲养细胞：细胞密度过低不利于细胞生长繁殖常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞其中还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过周，不影响杂交瘤细胞的纯化。饲养细胞骨髓瘤细胞与淋巴细胞()内加完;内加培养液融合方法细胞与脾细胞的比例为：～的（无菌，预温℃）在分钟内滴完,静置秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止作用根据细胞数量加入培养基，使之分加到孔板中时每孔细胞数为（～）×个。融合后天，换用培养液细胞融合～天出现克隆筛选挑克隆融合细胞的早期培养酶与酶：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）杂交瘤细胞的选择性培养应用液：杂氮鸟嘌呤聚乙二醇培养基：（）:次黄嘌呤（）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断合成主要途径()：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成选择作用：淋巴细胞：不能生长，天死亡；合成的主要途径被阻断骨髓瘤细胞：不能生长，天死亡；缺乏，合成的替代途径受阻:，;长命脾细胞:，;短命(天)杂交瘤细胞，;长命骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞杂交瘤细胞：长期生长繁殖利用淋巴细胞的，将合成为嘌呤碱并最终与一起合成从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力有限稀释法()显微操作法()法（）软琼脂平板法()二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含～个细胞有限稀释法效率最高价格昂贵配制方案：杂交瘤细胞（（～）)细胞冻存液(～牛血清，～培养液，)“慢冻”：分步冷冻，℃→℃→液氮“快融”：取出立即浸入℃～℃水浴中，使其迅速融化、复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义第二节单克隆抗体的制备经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。一、单克隆抗体的产生动物体内诱生方法：每次用或代小鼠，（～）×...
