定量PCR原理及PCR仪光学原理VIP免费

1定量PCR技术原理陈云地8008100192，021-64736366-407chenydappliedbiosystems2基本概念定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理等位基因鉴定原理定量PCR仪光学原理内容提要3reverseprimerforwardprimer3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'什么是PCR链式反应的雪崩效应3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'4平台期典型的PCR分4个阶段线性增长期基线期指数增长期5N=N0x(1+E)nN:扩增子数量N0:起始模板数量E：扩增效率n:循环数PCR理论方程6PCR方程只在指数期成立Log[DNA]Log[DNA]循环数线性增长期平台期y=x(1+e)n指数增长期7同一个样品重复96次起点定量与终点定量终点定量起点定量起始DNA量是样本中本来的量，更有意义；终点DNA量经过PCR“加工”，不是研究所需要的数据起点定量误差小，终点定量误差大8标准曲线方法标准品未知样本定量PCR的数学原理10什么是CT值荧光信号有统计学意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数CT值半对数图谱CT值线性图谱CT值与起始DNA浓度的关系CT值lg起始DNA浓度CT=-klgX0+b12为什么CT起始DNA浓度?总信号=本底信号+分子数量单位信号强度Rn第n个循环时的总信号RB本底RS单位信号强度X0起始DNA数目EPCR效率Rn=RB+X0(1+E)nRs13为什么CT起始DNA浓度?当循环次数n=CT值时：RT=RB+X0(1+E)CTRslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs)1log(log)log()1log(logXSBTXOTERRREXC即CT=-klgX0+b（线性方程）Rn=RB+X0(1+E)nRs14什么是阈值基线范围阈值标准偏差基线信号的标准偏差x1015CT值基线阈值基线调整规则如果CT值>18，不需调整，使用自动分析结果如果CT值<18，修改终点，再分析一次起点：进口试剂取3，国产试剂取6终点：最小的CT值–4，通常为15长度：大于或等于6个循环基线阈值CT值16PCR方程只在指数期成立Log[DNA]Log[DNA]循环数线性增长期平台期y=x(1+e)n指数增长期CT值和阈值必须位于指数增长阶段内171.实验结束，软件根据默认值的基线(3-15)自动分析，给出结果和图谱2.如果CT值>18，使用自动分析结果，出报告3.如果有CT值<18，根据[最小的CT值-4]修改基线终点，重新分析数据手工数据分析方法18软件自动的数据分析方法软件自动计算全部参数：基线、阈值、CT值、浓度定量PCR的化学原理20两种定量化学•染料染色–SYBR®GreenI–溴乙锭(EthidiumBromide)•探针标记–TaqManTM–TaqManMGB–Dual-oligoFRETpairs–分子信标(Molecularbeacons)–ScorpionsTM/AmplifluorTM21TaqMan探针的结构3'5'RQ3'3'5'5'3'5'5'22TaqMan探针定量原理reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.聚合probeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.链取代Q3'3'5'5'3'5'5'3.探针被切断R3'5'5'3'5'5'4.聚合完成QRR=报告基团ReporterQ=淬灭基团Quencher3'TaqMan探针的共振能量转移25Taq酶的5’→3’外切活性26TaqManMGB探针的好处FAMFAMMGB完全配对，有信号FAMFAMMGB一个碱基不配对，没有信号MGB探针能够分辨1个碱基的差别27TaqManMGB探针原理AGGCCTTGAGAGATATRGCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACACAGGCCTTGAGAGATATR||||||||||||||||QQ(non-fluorescentquencher)NFQQMGB(minorgroovebinder)NFQMGBR报告荧光无荧光淬灭基团小沟结合物提高探针Tm值28–提高Tm值15mer提高18°C–探针更短只要13-19个碱基–更多一重PCR–提高信噪比–没有背景荧光–更高的淬灭效率RQMGBNFQ53MGB探针的优势29Tm决定探针杂交特异性•Tm=Tm配对-Tm不配对•要有效地区分等位基因，退火/延伸温度必须落在Tm区间内TAMRATm=65Tm=59(Tm=6°C)MGBTm=65Tm=49(Tm=17°C)70°C65°C60°C55°C50°C30两种探针比较TAMRA0.00.20.40.60.81.01.21.40510152025303540CycleNumberRnMGBTAMRA探针：长38-mer:ACTTTTCTGTAAGTAGATATAACTTTTCAAAAAGACAGMGB探针：长17-mer:CTGTAAGTAGATATAAC31分子信标(Molecularbeacon)TaqMan探针的衍生形式32杂交双探针变性退火延伸完成33探针法小结NoBlots!NoGels!既灵敏又特异：PCR与分子杂交的结合双倍放大：PCR放大与荧光放大的结合34与DNA结...