DNA提取原理

DNA 提取原理 1．溶液I—溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH 小于 8 时，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA 受机械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合 Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对 DNA 的降解作用（DNase 作用时需要一定的金属离子作辅基） ;（2）EDTA 的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 2．溶液II－ NaOH－SDS 液：NaOH：核酸在 pH 大于 5，小于 9 的溶液中，是稳定的。但当 pH＞12 或 pH＜3 时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II 中的NaOH浓度为 0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH 就高达 12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA 的变性。 SDS：SDS 是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS 能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程 中，必 须 把 它去 除 干 净 ，防止在下一步 操 作中（用 RNase 去 除 RNA 时）受到干 扰 。 3. 溶液III— 3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc 的水溶液呈 碱 性，为了 调 节 pH 至 4.8，必 须加入 大量 的冰 醋 酸。所以该溶液实 际 上是NaAc-HAc 的缓 冲 液。用 pH4.8 的NaAc溶液是为了 把pH12.6 的抽提液，调 回pH 至 中性，使变性的质粒DNA 能够 复性，并 能稳定存在。而高盐 的3mol／L NaAc 有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝 聚而沉淀之。前 者 是因为中和 核酸上的电 荷 ，减 少 相 斥力而互 相 聚合，后者 是因为钠 盐 与SDS－蛋白复合物作用后，能形 成较小的钠 盐形 式 复合物，使沉淀更 完 全 。 4．为什 么 用无 水乙 醇 沉淀DNA？ 用无 水乙 醇 沉淀DNA，这 是实 验 中最 常 用的沉淀DNA 的方 法 。乙 醇 的优 点 是可 以任 意 比 和 水相 混 溶，乙 醇 与核酸不 会起任 何 化学反应，对 DNA 很 安 全 ，因此 是理想 的沉淀剂。 DNA 溶液是DNA 以水合状 态 稳定存在，当加入 乙 醇 时，乙 醇 会夺 去 DNA 周 围 的水...