暑 期 实 验 生 化 部 分 一 实 验 目 的 1． 了 解 基 本 的 分 离 提 纯 蛋 白 质 的 原 理 方 法 和 技 术 。 2． 提 取 分 子 和 微 生 物 实 验 中 自 制 重 组 细 菌 产 生 的 蛋 白 质 HSP16.3。 3． 测 定 HSP16.3 的 分 子 活 性 ， 了 解 其 分 子 伴 侣 活 性 及 寡 聚 结 构 。 4． 提 纯 和 检 测 Tag 酶 蛋 白 。 二 背 景 介 绍 1． HSP16.3 HSP16.3 是 来 自 结 核 杆 菌 M.tuberculosis 的 小 分 子 量 热 休 克 蛋 白 (430bp)。 HSP16.3 在正 常 条 件 下 仅 有 少 量 表 达 ， 当 M.tuberculosis 从 对 数 期 到 稳 定 期 的 转 变 中 显 著 表 达 ， 并 成为 细 胞 内 的 主 要 蛋 白 。 另 外 ， HSP16.3 还 是 M.tuberculosis 很 强 的 抗 原 性 蛋 白 ， 是 T， B 细胞 发 生 免 疫 反 应 的 重 要 靶 点 。 体 外 实 验 表 明 ， HSP16.3 具 有 分 子 伴 侣 的 活 性 ， HSP16.3 在39.5℃ 时 可 以 抑 制 柠 檬 酸 合 成 酶 的 热 聚 集 ， 且 其 活 性 不 依 赖于ATP， 但不 能保护柠 檬 酸 合 成酶 的 活 性 ， 说明 HSP16.3 是 与部 分 去折叠的 柠 檬 酸 合 成 酶 发 生 作用， 体 内 蛋 白 的 再折叠可 能还 需要 其 它蛋 白 参与。 通过凝胶层析还 可 分 离 出HSP16.3 与柠 檬 酸 合 成 酶 形成 的 复合 物 ， 并在 随后的 SDS-PAGE 中 得到 证实 。 HSP16.3 可 能是 通过暴露疏水表 面来 行使其 分 子 伴 侣 活 性的 。 实 验 表 明 ：HSP16.3 在 较温和 温度和 低浓度变 性 剂诱导下 ， 如极低浓度的 盐酸 胍（0.05 M）， 尿素（0.3 M）或30℃ 的 温度处理 时 ， 会暴露疏水表 面使得其 分 子 伴 侣 活 力迅速上升。 HSP16.3 是144 个氨基 酸 组 成 的 ， 分 子 量 为16277Da ， 其 序列分 析结 果表 明 它属于-crystalline 相关的 小 分 子 量 热 休 克 蛋 白 （sHSP）家族的 一 员， 具 有-crystalline 蛋白 家族典型的 C 末端保守序列：D/N-G-V-L-T-T/V-X-V/A。 小 分 子 量 热 休 克 蛋 白...
