三种消化酶测定

蛋白酶活力的测定 [目的与原理] 掌握蛋白酶活力的测定方法，测定鱼、虾、贝等水产动物主要消化器官肝胰脏、胃、肠等蛋白酶的活力。 动物消化器官内含有各种消化腺，这些消化腺分泌消化酶进行化学性消化作用，将机体摄入的大分子营养物质转变为可溶性小分子物质而吸收进入血液循环。本实验采用福林—酚法测定机体内主要消化酶—蛋白酶活力。福林—酚试剂（Folinphenol）在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物。蛋白质中含有酚基的氨基酸包括（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用蛋白酶分解酪蛋白（底物），生成含酚基的氨基酸与福林－酚试剂成蓝色反应，可从蓝色的深浅测知酶活力多少。 [试剂与器材] 试剂： 1、福林试剂：在 2000ml 磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2 H2O）100g，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g，水 700ml，35％磷酸 50ml，浓盐酸 100ml，文火回流 10 小时，然后加人硫酸锂 50g，水 50ml 和溴水数滴，摇匀，去除冷凝器，继续煮沸 15 分钟，以除去多余的溴。溶液呈金黄色，冷却后，定容至 1000ml，过滤，滤液即福林试剂（试剂不应呈绿色，否则需重配）。置于棕色瓶中保存，使用时用氢氧化钠标定，稀释至 1N。 2、0.55M 碳酸钠溶液 3、10％三氯乙酸 4、0.02M pH7.5 磷酸缓冲液： 0.02M 磷酸氢二钠溶液的配制：取 Na2HPO4·2H2O 3.561g (或Na2HPO412H2O 7.164g)，溶解于 1L 蒸馏水中。0.02M 磷酸二氢钠溶液的配制：取NaH2PO4 H2O 2.76g (或 NaH2PO4 2H2O 3.121g)，溶解于 1L 蒸馏水中。 将 0.02M 磷酸氢二钠溶液 84ml 与0.02M 磷酸二氢钠溶液 16ml 混合，即为 0.02M pH7.5 磷酸缓冲液。 5、0.5％酪素：（酪蛋白）0.5 克，以 0.5N NaOH 1ml 湿润。再加少量 0.02MpH7.5磷酸缓冲液稀释。在热水浴中溶解，定容至 100ml，冰箱中可保存一周。 材料： 鲜活鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。 器材： 分光光度计、光径 1.0cm 比色杯、离心管、电子天平、离心机、匀浆器、剪子、镊子、冰块、试管若干、移液管若干。 [实验步骤] 1、酶粗提液的制备 取新鲜肝胰脏、胃、肠组织称重，在冰盘上剔除脂肪及内容物，以 10 倍缓冲液或去离子水匀浆各组织，将组织悬液低温下离心（3000rpm/min）,上清液为酶粗提液（酶液）。 2、酶活力测定 （1）标准曲线的制作：精确称取烘干的酪氨酸 50mg，加少量 0.2N 盐酸溶解，定容至100ml，分别配制溶液 0—100μg/ml不...