最常用的20个生物实验技术及原理

下载后可任意编辑最常用的 20 个生物实验技术及原理一、mRNA 的分离与纯化（寡聚(dT)纤维素柱纯化 mRNA）真核细胞的 mRNA 分子最显著的结构特征是具有 5’端帽子结构（m7G）和3’端的 Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞 mRNA 的 3’端存在 20-30个腺苷酸组成的 Poly（A）尾，通常用 Poly（A+）表示。这种结构为真核mRNA 的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化 mRNA 的理论基础就在于此。mRNA 的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用 mRNA3’末端含有 Poly（A+）的特点，在 RNA 流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA 被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA 被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的 mRNA。二、RNA 酶保护试验方法(RNaseProtectionAssay，RPA)RNA 酶保护法是近十年进展起来的一种全新的 mRNA 定量分析方法。基本原理：将标记的特异 RNA 探针（32P 或生物素）与待测的 RNA 样品液相杂交，标记的特异 RNA 探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链 RNA；未结合的单链 RNA 经 RNA 酶 A 或 RNA 酶 T1 消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异 RNA 探针结合后形成双链 RNA，免受RNA 酶的消化，故该方法命名为 RNA 酶保护实验。与 Northernblot 和 RT-PCR 比较，RPA 有以下几个优点：1.检测灵敏度比 Northern 杂交高。由于 Northern 杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而 RPA 将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。下载后可任意编辑2.由于 PCR 扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于 PCR 产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而 RPA 没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。3.由于与反义 RNA 探针杂交的样品 RNA 仅为该 RNA 分子的部分片段，因此，部分降解的 RNA 样品仍可进行分析。4.步骤较少，耗时短。与 Northern 杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。5.RNA-RNA 杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。6.一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7.检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA 的缺点是需要同位素标记探针。三、染色质免疫共沉淀技术（ChromatinImmunoprecipit...