免疫组化及PCR操作流程

细胞免疫组化步骤 1. PBS 冲洗两次 2. 丙酮固定10min 3. 浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 0.05 ml+PBS 2ml) 37℃ 30 min 4. PBS 振洗2 次,每次3min 5. 加封闭血清,湿盒内 37℃ 30 min 6. 弃去血清 7. 加一抗, 37℃ 30~60min (1:200 1:150 稀释) 8. PBS 振洗3 次,每次3min 9. 加二抗, 37℃ 30 min 10. PBS 振洗3 次,每次3min 11. 加 ABC 复合剂, 37℃ 30 min 12. PBS 振洗2 次,THB(Tris-HCl 缓冲液 0.5mol/l,PH 7.6 )振洗1 次,每次3min 13. 浸入新鲜底物溶液（DAB50mg+100ml THB）,在室温下暗处 10~20min 14. 自来水洗5min 15. 染核 浸入苏木素染液 2min,自来水洗，迅速过盐酸酒精， 自来水洗，过氨水，自来水洗 16. 逐级脱水，70％1 次，95％2 次，无水 3 次 每次1min 17. 透明，过二甲苯 3 次，每次1min 18. 封片 将有细胞的一面向下封片 一、 免疫组化操作规程 （一）、仪器设备 1）18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉； 2）水浴锅 （二）、试剂 1）PBS 缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。 2）0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 3）0.5mol/L EDTA 缓冲液（pH8.0）：700ml 水中溶解 186.1gEDTA·2H2O，用 10 mmol/L NaOH 调至 pH8.0,加水至 1000ml。 4）1mol/L 的 TBS 缓冲液（pH8.0）：在 800ml 水中溶解 121gTris 碱，用 1N 的 HCl 调至 pH8.0,加水至 1000ml。 5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用 0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用 0.1N 的 HCl配制。 6）3%甲醇-H2O2 溶液：用 30%H2O2 和 80%甲醇溶液配制。 7）封裱剂： a、甘油和 0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合； b、油和 TBS(或 PBS)配制。 8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4 适合于光学显微镜标本。 （三）、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60 分钟或 60℃恒温箱中烘烤20 分钟。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10 分钟，更换二甲苯后再浸泡10 分钟； 2）无水乙醇中浸泡5 分钟； 3）95%乙醇中浸泡5 分钟； 4）70%乙醇中浸泡5 分钟； 2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1）抗原热修复 （1）高压热修复在沸...