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免疫组化及PCR操作流程

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细胞免疫组化步骤 1. PBS 冲洗两次 2. 丙酮固定10min 3. 浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 0.05 ml+PBS 2ml) 37℃ 30 min 4. PBS 振洗2 次,每次3min 5. 加封闭血清,湿盒内 37℃ 30 min 6. 弃去血清 7. 加一抗, 37℃ 30~60min (1:200 1:150 稀释) 8. PBS 振洗3 次,每次3min 9. 加二抗, 37℃ 30 min 10. PBS 振洗3 次,每次3min 11. 加 ABC 复合剂, 37℃ 30 min 12. PBS 振洗2 次,THB(Tris-HCl 缓冲液 0.5mol/l,PH 7.6 )振洗1 次,每次3min 13. 浸入新鲜底物溶液(DAB50mg+100ml THB),在室温下暗处 10~20min 14. 自来水洗5min 15. 染核 浸入苏木素染液 2min,自来水洗,迅速过盐酸酒精, 自来水洗,过氨水,自来水洗 16. 逐级脱水,70%1 次,95%2 次,无水 3 次 每次1min 17. 透明,过二甲苯 3 次,每次1min 18. 封片 将有细胞的一面向下封片 一、 免疫组化操作规程 (一)、仪器设备 1)18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉; 2)水浴锅 (二)、试剂 1)PBS 缓冲液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L,KH2PO4 1.4mmol/L。 2)0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。 3)0.5mol/L EDTA 缓冲液(pH8.0):700ml 水中溶解 186.1gEDTA·2H2O,用 10 mmol/L NaOH 调至 pH8.0,加水至 1000ml。 4)1mol/L 的 TBS 缓冲液(pH8.0):在 800ml 水中溶解 121gTris 碱,用 1N 的 HCl 调至 pH8.0,加水至 1000ml。 5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用 0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液:用 0.1N 的 HCl配制。 6)3%甲醇-H2O2 溶液:用 30%H2O2 和 80%甲醇溶液配制。 7)封裱剂: a、甘油和 0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液(pH9.0~9.5)等量混合; b、油和 TBS(或 PBS)配制。 8)TBS/PBS pH9.0~9.5,适用于荧光显微镜标本;pH7.0~7.4 适合于光学显微镜标本。 (三)、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前,应将组织芯片在室温中放置60 分钟或 60℃恒温箱中烘烤20 分钟。 1)组织芯片置于二甲苯中浸泡10 分钟,更换二甲苯后再浸泡10 分钟; 2)无水乙醇中浸泡5 分钟; 3)95%乙醇中浸泡5 分钟; 4)70%乙醇中浸泡5 分钟; 2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1)抗原热修复 (1)高压热修复在沸...

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