精品文档---下载后可任意编辑hIL-15-SA 双功能融合蛋白中试工艺讨论的开题报告一、讨论背景和意义细胞因子具有调节免疫反应和细胞增殖的重要作用，成为肿瘤治疗和免疫治疗的讨论热点。IL-15 是一种强效的免疫调节因子，可以激活NK 细胞和 CD8+ T 细胞，增强它们对肿瘤细胞的杀伤作用，促进机体产生免疫应答，并且具有抗病毒和抗癌的作用。但是 IL-15 的生物学活性比较短暂，不能长时间发挥其免疫调节作用。为了克服这个缺点，近年来出现了一种新型的融合蛋白——双功能融合蛋白，可以同时携带 IL-15和 SA（Staphylococcus aureus protein A）两个功能区，具有较长的生物学半衰期和较高的生物学活性。双功能融合蛋白的制备过程需要进行表达、纯化和检测等步骤，其中纯化是关键的一个环节。采纳常规的蛋白质纯化方法往往会造成蛋白质的损失和污染，影响纯度和活性。因此，需要讨论适合双功能融合蛋白纯化的新型工艺，提高纯度和产率，为其进一步应用打下基础。二、讨论内容和目标本讨论旨在探究一种适合双功能融合蛋白 IL-15-SA 的中试工艺，包括表达载体构建、细胞培育、表达和纯化等步骤。具体内容如下：1. 构建双功能融合蛋白 IL-15-SA 的表达载体，包括质粒构建、酶切和连接等步骤。2. 利用 HEK293 细胞进行表达，优化培育条件，包括菌种的选取、平板和液体培育基的配方、药物诱导剂和时间等因素。3. 对表达融合蛋白后的菌体进行裂解，评估选择最佳的裂解方法。4. 采纳亲和层析法进行纯化，讨论选择最佳的亲和层析介质和条件，以及洗脱和再生的工艺参数。5. 评估纯化后的双功能融合蛋白的纯度、活性和稳定性等指标。三、讨论方法和步骤1. 质粒构建：设计合成 IL-15 和 SA 的引物，采纳 PCR 扩增两个功能区的基因，利用 SOE-PCR 方法进行双功能融合，然后克隆到表达载体上。2. 细胞培育：选择 HEK293 细胞进行表达，优化平板和液体培育基的配方和菌种的选取，进行细胞扩增和药物诱导。精品文档---下载后可任意编辑3. 菌体裂解：优化菌体裂解的方法和参数，如菌体的质量浓度、裂解液的 pH 值和离子浓度、裂解时间和温度等。4. 亲和层析纯化：讨论选择最佳的亲和层析介质和条件，如介质的类型、维持液的浓度和 pH 值、洗脱缓冲液的复杂度和浓度等。5. 产品检测：通过 SDS-PAGE、Western blot、ELISA 等方法对纯化后的融合蛋白进行纯度、活性和稳定性等方面的评估。四、讨论预期成果1. 成功构建双功...
