实验六 肝糖原的提取、鉴定与定量 (生物化学实验操作考核卷) 姓名 ,学号 , 专业, 级 班 组, 月 日 目的要求: 1. 掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。 2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。 3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4. 熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况,采用合适的混匀方法)。 5. 正确掌握溶液转移的操作。 6. 正确操作使用分光光度计。 实验原理: (一)肝糖原的提取、鉴定 糖原储存于细胞内,采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用 95%乙醇将滤液中糖原沉淀,再溶于热水中。 糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的存在。 CuSO4 十2NaOH ═ Na2 SO4+Cu(OH)2↓ 2Cu(OH)2 十C6H12O6 ═ 2CuOH 十氧化型葡萄糖+H2O 2CuOH ═ Cu2O↓(红色)+H2O Cu(OH)2 ═ CuO↓(黑色)+H2O (二)肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm 处有最大吸收。糖含量在(10100)g 范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色,通过标准对照法(直接比较法)即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其它成分,而保留肝糖原。 实验材料: (一)仪器 1. 普通离心机,室温100℃恒温水浴箱(×2),722型分光光度计,精度为10mg级电子天平(×1) 2. 剪刀(×1),镊子(×1),研钵(×1) 3. 试管架(×1),10mL 离心管(×2),(100×15)mm 试管(×6) 4. 刻度吸量管(2mL×1,5 mL×2),1000μ L 微量可调取液器(×1) 5. 100mL 容量瓶(×1) 6. 白瓷反应板(×1) (二)实验样品和试剂 1. 鸡肝。 2. 95%乙醇。 3. 0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液:称取未潮解的三氯醋酸(C2HCl3O2,163.39)5g,...