总RNA的提取与RT、RealtimePCR

总RNA 的提取与RT、Realtime-PCR 一、实验原理 RNA 是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。获得高纯度和完整的 RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如 Northern 杂交、cDNA 合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于 RNA 的质量。 由于细胞内的大部分 RNA 是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取 RNA 时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与 RNA 分离，释放出 RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使 RNA 与其他细胞组分分离，得到纯化的总 RNA。 1．RNA 提取的最大影响因素-RNA 酶 但是由于 RNA 酶（RNase）广泛存在且稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压等。RNase 催化的反应一般不需要辅助因子，因而 RNA 制剂中只要存在少量的 RNase 就会引起 RNA 在制备与分析过程中的降解，所以 RNA 的制备过程中要抑制内源和外源的 RNase 活性，保护 RNA 分子不被降解。 外源性的 RNase 存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的 RNase 也会造成污染。这些外源性的 RNase 可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的 RNase。 2．常用的 RNA 酶抑制剂 *焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的 RNase 抑制剂。它通过和 RNase 的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 *异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的 RNase 抑制剂，它在裂解组织的同时也使 RNase 失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对 RNase 有强烈的变性作用。 *氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和 RNase 结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制 RNase 的活性。 *RNA 酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin 是 RNase 的一种非竞争性抑制剂，可以和多种 RNase 结合，使其失活。 *其它：SDS、尿素、硅藻土等对 RNase 也有一定抑制作用。 3．防止 RNase 污染的措施、RNA 提取之前需要注意和准备的工作 *尽可能在实验室专门辟出 RNA 操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用。RNA 操作区应保持清洁，并定期进行除菌。 *操作过程中应始终戴一次性橡胶手套和口罩，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的 RNase 带入各种容器...