标准的PCR反应体系

标准的PCR 反应体系 PCR 反应体系与反应条件 -------------------------------------------------------------------------------- 标准的PCR 反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4 种 dNTP 混合物 各 200umolL 引物 各 10～100mol 模板 DNA 01～2ug TqDNA 聚合酶 25u g2+ 15mmolL 加双或三蒸水至 100ul PCR 反应五要素：参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 g2+ 引物：引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30b，常用为 20b 左右。 ②引物扩增跨度：以 200-500b 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 ③引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免5 个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物 3'端的碱基，特别是最末及 倒 数 第 二个碱基，应严 格 要求 配 对 ，以避免因 末端碱基不配 对 而 导 致 PCR 失 败 。 ⑥ 引物中 有或能加上合适 的酶切 位 点 ，被 扩增的靶 序列最好有适 宜的酶切 位 点 ，这 对 酶切 分析 或分子 克 隆 很 有好处 。 ⑦ 引 物 的 特 异 性 ： 引 物 应 与 核 酸 序 列 数 据 库 的 其 它 序 列 无 明 显 同 源 性 。 引 物 量 ： 每 条 引物 的 浓 度01～ 1umol 或10～ 100mol， 以 最 低 引 物 量 产 生 所 需 要 的 结 果 为 好 ， 引 物 浓 度 偏高 会 引 起 错 配 和 非 特 异 性 扩 增 ， 且 可 增 加 引 物 之 间 形 成 二 聚 体 的 机 会 。 酶 及 其 浓 度 目 前 有 两 种 TqDNA 聚 合 酶 供 应 ，一 种 是 从 栖 热 水 生 杆 菌 中 提 纯 的 天 然酶 ， 另 一 种 为 大 肠 菌 合 成 的 基 因 工 程 酶 。 催 化 一 典 型 的PCR 反 应 约 需 酶 量2。 5U(指 总 反 应体 积 为 100ul 时 )，...