蛋白印迹操作流程

蛋白印迹操作流程蛋 白 印 迹 ， 也 称 Western ， Western blot 、 Western blotting、Western 印迹，简称 WB，是用免疫学方法检测蛋白，讨论蛋白质的表达调控的重要方法之一。蛋白印迹可以参考如下步骤进行操作. 1.蛋白样品的制备(Protein sample preparation) 可以选用适当的裂解液，如赛驰生产的 WIP 细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，如赛驰生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 为确保每个蛋白样品的上样量一致,收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。如使用我公司生产的 WIP 细胞裂解液,可以使用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒。 2. 电泳(Electrophoresis) (1）SDS—PAGE 凝胶配制 SDS-PAGE 凝胶可以参考文献资料进行配制,也可以使用赛驰生产的 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度 SDS—PAGE 的配方。 （2）样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的 SDS—PAGE 蛋白上样缓冲液，放置于水漂上于 100℃或沸水浴中加热 3-5 分钟，以充分变性蛋白。使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料自行配制，也可以使用赛驰生产的 SDS—PAGE 蛋白上样缓冲液(5X)。 （3) 上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到 SDS-PAGE 胶加样孔内即可电泳，电泳缓冲液可以参考相关文献资料自行配制，也可以使用赛驰生产的 SDS—PAGE 蛋白电泳缓冲液（10X）.为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及推断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准 。电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在 80-100V，高电压可设置在 120V 左右。 采纳普通的电泳仪就可以满足 SDS—PAGE 电泳的要求，也可以采纳赛驰提供的多功能电泳仪。为方便起见，也可整个 SDS—PAGE 电泳过程均采纳恒压的方式,通常把电压设置在 100V,然后设定时间为 90－120 分钟.设置定时可以避...