碱裂解法提取质粒一、基本概念 1.质粒:质粒就是染色体外能够进行自主复制得遗传单位,包括真核生物得细胞器与细菌细胞中染色体以外得脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌与放线菌等生物中染色体以外得 DNA 分子。在基因工程中质粒常被用做基因得载体。许多细菌除了染色体外,还有大量很小得环状 DNA 分子,这就就是质粒(plasmid)。质粒上常有抗生素得抗性基因,例如,四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome),这类质粒能够整合进细菌得染色体,也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外得 DNA 分子。 目前,已发现有质粒得细菌有几百种,已知得绝大多数得细菌质粒都就是闭合环状 DNA 分子(简称 cccDNA)。细菌质粒得相对分子质量一般较小,约为细菌染色体得 0、5%～3%。根据相对分子质量得大小,大致上可以把质粒分成大小两类:较大一类得相对分子质量就是 40×106 以上,较小一类得相对分子质量就是 10×106 以下(少数质粒得相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中得质粒数主要决定于质粒本身得复制特性。根据复制性质,可以把质粒分为两类:一类就是严紧型质粒,当细胞染色体复制一次时,质粒也复制一次,每个细胞内只有 1～2 个质粒;另一类就是松弛型质粒,当染色体复制停止后仍然能继续复制,每一个细胞内一般有 20 个左右质粒。一般分子量较大得质粒属严紧型。分子量较小得质粒属松弛型。质粒得复制有时与它们得宿主细胞有关,某些质粒在大肠杆菌内得复制属严紧型,而在变形杆菌内则属松弛型。 在基因工程中,常用人工构建得质粒作为载体。人工构建得质粒可以集多种有用得特征于一体,如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用得人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。pBR322 含有抗四环素基因(Tcr)与抗氨苄青霉素基因(Apr),并含有 5 种内切酶得单一切点。假如将 DNA 片段插入 EcoRI 切点,不 会 影 响 两 个 抗 生 素 基 因 得 表 达 。 但 就 是 假 如 将 DNA 片 段 插 入 到HindIII、BamHI 或 SalI 切点,就会使抗四环素基因失活。这时,含有 DNA 插入片段得 pBR322 将使宿主细菌抗氨苄青霉素,但对四环素敏感。没有 DNA 插入片段得 pBR322 会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素,而没有 pBR322 质粒得细菌将对氨苄青霉素与四环素都敏感。pSC101 与 pBR322 相似,只就是没有抗氨苄青霉素基因与 PstI 切点。质粒运载体得最大插入片段约为 10kb...
