双缩脲法测定蛋白质含量

双缩脲法测定蛋白质含量(3页)Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。实验二十 蛋白质含量测定——双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。二、实验原理在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为 1～10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 三、实验试剂和器材[试剂]1．双缩脲试剂： 取 CuSO4·5H20(c.P.)1.5g 和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g 以少量蒸馏水溶解，再加 2.5mol／L NaOH 溶液 300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。 2．标准蛋白质溶液： 用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成 10g/L 的标准蛋白溶液，可用 BSA 浓度 1g/L 的 A280 为 0.66 来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或 0.9%NaCl 配制，酪蛋白用 0.05mol/L NaOH 配制。 [器材] 1．试管：15×150mm 试管 7 只； 2．1ml，5ml 移液管；3．坐标纸 ；4．721 分光光度计。 四、实验操作取试管 7 支，编号，按下表操作： 试剂(ml)\管号空白管12345测定管蛋白标准液-0.10.20.30.40.5–（10g/L）生理盐水0.50.40.30.20.1-0.4待测样品------0.1双缩脲试剂3.03.03.03.03.03.03.0相当蛋白质（g/L）01020304050- 混匀，37℃水浴 20 分钟，冷却至室温，在分光光度计波长 540nm 处，用空白管调零，读取各管吸光度值。1～5 为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。以测定管的吸光度，在标准曲线上求得蛋白质浓度。[注意事项]...