实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定

实验 8 植物组织中可溶性蛋白质含量得测定Ⅰ。斐林—酚试剂法 [原 理］ 斐林(Foli ｎ)-酚试剂法结合了双缩脲试剂与酚试剂与蛋白质得反应， 其中包括两步反应:第一步就是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物;第二步就是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝与磷钨蓝得深蓝色混合物,颜色深浅与蛋白含量成正相关.在 650nm 时比色测定得灵敏度比双缩脲法高 100 倍.由于肤键显色效果增强,从而减少了因蛋白质种类引起得偏差。该法适于微量蛋白得测定（范围为５～l00μg 蛋白质）。 ［材料、仪器设备及试剂］（一)材料 各种植物材料. (二)仪器设备 722 分光光度计,离心机,恒温水浴,定量加样器，冷凝回流装置一套,研钵,离心管，刻度移液管,微量滴定管，试管等。 (三）试剂 （1）0。５ m ｏｌ／L Na0H。 （2）斐林－酚试剂甲液：由 A、B 两种溶液组成：Ａ液：4％碳酸钠（Ｎ a2C03)溶液与 0、2mol／L 氢氧化钠(Ｎ a ０ H）溶液等体积混合.B 液:1%硫酸铜（C ｕ S04·５ H ２ 0)溶液与 2％酒石酸钾钠溶液等体积混合。使用前将 A 与 B 按 5 ０：1 得比例混合即成,此试剂只能在使用当天配制。 （3）斐林—酚试剂乙液：称取钨酸钠（Na2 Ｗ 04.H20)100 ｇ,钼酸钠(Ｎa2Mo04·2H20)２ 5g，加蒸馏水 700 ｍ l 溶解于１５ 00mL 得圆底烧瓶中。之后加入 85%得 H ３ PO450mL,浓 Hcl １ 00 mL,安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来),使其慢慢沸腾 10h。冷却后加入硫酸锂（Li ２ SO4、H2O）150g，蒸馏水５０ m ｌ,溴水２-3 滴,打开瓶口煮沸 1５ min，以逐出过量得溴，冷却后溶液呈黄色(若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸 15m ｉｎ).待冷却后稀释至 1000ml，过滤入棕色瓶中保存。使用时大约加水 1 倍，使最终浓度相当于 1mol/Ｌ酸度。因此在使用前应进行标定.标定方法：取５ m ｌ福林-酚试剂乙液放入锥形瓶内,用 1 ｍｏ l/L 标准氢氧化钠溶液滴定,酚酞作指示剂，当溶液突然转红再转灰绿时，即为滴定终点。计算其相当得酸度，用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于１mo ｌ／L 得酸度. 在测定时要注意,因为酚试剂仅在酸性稳定，但此实验得瓜只在 pH≠１ 0 得情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。⑷ 标准蛋白质溶液：称取 25m ｇ牛血清...