鸡胚原代细胞培育 [实验材料]9～10 日龄鸡胚，Hank"s 液 50mL，0．5％水解乳蛋白液或 MEM 培育液 20mL(内含犊牛血清 1mL，双抗 0．2mL，pH7．2)，O．25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL，手术剪，镊子，灭菌的培育皿，50mL 三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培育用)，高压灭菌塞子若干，培育盘，蛋座，95％酒精，水浴锅。[实验内容及操作程序]1．配液制备细胞前先在 Hnak"s 液中加青、链霉素，使其含量为青霉素 100IU/mL，链霉素 100μg/mL，用 7％NaHC03 调整 pH 至 7．2～7．4，将胰蛋白酶调整pH7．6(玫瑰红色)。置 37℃水浴锅中预热备用。2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，用 Hank"s 液 ( 简称 H 液 ) 洗去体表血液 ，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约 1mm3 大小的碎块，加 5mL H 液轻摇，静止 1～2min，使其组织块下沉。吸去上层悬液，依同法再洗 2 次，至上悬液不混浊为止，吸干 H 液留组织。3．消化自水浴锅内取出预热的胰酶，按组织块量约 3～5 倍加入三角瓶中，1 个 鸡胚约需 5mL 胰酶 ，三角瓶上加塞，以免 CO2 挥发及污染。37℃水浴约 20min左右，每隔 5min 轻轻摇动 1 次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，假如消化不够，则细胞不易分散。4．洗涤取出三角瓶后静置 1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用 10mL Hank"s 液反复轻洗 3 次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。5．吹打加 2mL 含血清的 0．5％水解乳蛋白营养液或：MEM 培育液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。静置 1min，使未冲散的组织块下沉后，小心地将细胞悬液吸出 1mL 于 20mL 营养液中，此液细胞数约 50 万～70 万/mL。如需大量细胞，可继续加营养液冲打，一个鸡胚约可做 100mL 细胞悬液。6．细胞计数取上述细胞悬液 0．5mL 加入 0．1％结晶紫一柠檬酸(0.1mol/L)溶液 2mL，置室温或 37℃温箱中 5～10min，充分振动混合后，用毛细管吸取滴人血细胞计数板内，在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法，计算四角大格内完整细胞的总...
